Question

15．為增加油菜種子的含油量，研究人員嘗試將酶D基因與位于葉綠體膜上的轉運肽基因相連，導入油菜細胞并獲得了轉基因油菜品種．

（1）研究人員依據基因的已知序列設計引物，從陸地棉和擬南芥的基因文庫中獲取酶D基因和轉運肽基因，所含三種限制酶（ClaI、SacI、XbaI）的切點如圖所示．則用ClaⅠ和DNA連接酶處理兩個基因后，可得到A端與D端（填圖中字母）相連的融合基因．
（2）將上述融合基因插入如圖所示Ti質粒的T-DNA中，構建基因表達載體（或“重組質粒”）并導入農桿菌中．將獲得的農桿菌接種在含四環素的固體培養基上篩選培養得到含融合基因的單菌落，再利用液體培養基震蕩培養，可以得到用于轉化的侵染液．
（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是利用農桿菌將融合基因導入油菜細胞．
（4）進一步篩選后獲得轉基因油菜細胞，該細胞通過植物組織培養技術，可培育成轉基因油菜植株．用核酸分子雜交法在分子水平上可檢測轉基因油菜植株中的融合基因是否成功轉錄．

Answer 1

分析 1、基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．
2、cDNA文庫和基因文庫的比較表：

文庫類型	cDNA	基因組文庫
文庫大小	小	大
基因中啟動子	無	有
基因中內含子	無	有
基因多少	某種生物的部分基因	某種生物的全部基因
物種間的基因交流	可以	部分基因可以

解答 解：（1）研究人員依據基因的已知序列設計引物，采用PCR法從陸地棉基因文庫中獲取酶D基因，從擬南芥基因文庫中獲取轉運肽基因．酶D基因的A端和轉運肽基因的D端都含有限制酶ClaⅠ的切割位點，因此可以用ClaⅠ限制酶和DNA連接酶處理兩個基因后，得到A、D端相連的融合基因．
（2）農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上．根據農桿菌的這一特點，如果將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上．因此，將上述融合基因插入圖乙所示Ti質粒的T-DNA中，構建表達載體并導入農桿菌中．由圖可知，標記基因是四環素抗性基因，因此將獲得的農桿菌接種在含四環素的固體平板上培養得到單菌落，再利用液體培養基震蕩培養，可以得到用于轉化的浸染液．
（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是利用農桿菌將融合基因導入油菜細胞，進一步篩選后獲得轉基因油菜．
（4）檢測目的基因是否成功導入受體細胞可采用DNA分子雜交技術．
故答案為：
（1）基因文庫    ClaⅠDNA連接    A   D
（2）基因表達載體（或“重組質粒”）    四環素
（3）利用農桿菌將融合基因導入油菜細胞     
（4）核酸分子雜交

點評 本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理、操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節問題，能結合圖中信息準確答題．