Question

13．圖甲表示某細菌的質粒中相關限制酶的切割位點，圖乙表示目的基因所在的DNA中相關限制酶的切割位點．請分析并回答下列問題：

（1）用SmaⅠ限制酶處理圖甲所示的質粒會得到2個DNA片段，用AluⅠ處理圖乙所示的外源DNA會增加2個游離的磷酸基團．
（2）為了避免目的基因和質粒在酶切后產生的片段發生自身環化或任意連接，以及便于篩選需要，在實際操作中，一般應選用PstⅠ和HindⅢ酶（填限制酶名稱）同時酶切質粒和含目的基因的外源DNA．再用DNA連接酶處理．如果是用PCR技術擴增目的基因，設計引物是關鍵，但在擴增時退火溫度一般為55～60℃，對于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%時一般用60℃，原因是G與C（之間是三個氫鍵）比例越高越穩定[或A與T（之間是兩個氫鍵）比例越高越不穩定]．
（3）為了篩選獲得含有重組質粒的大腸桿菌，實驗人員首先將經轉化處理過的大腸桿菌接種在含四環素（抗生素）的培養基中，然后用影印法將該培養基上的菌落按原來的方向印在含氯霉素（抗生素）培養基上，以篩選獲得含重組質粒的細菌．在含四環素培養基中能生長繁殖，而在含氯霉素培養基中不能生長繁殖的是導入了重組質粒（或目的基因）的大腸桿菌．

（4）經檢測：在上述導入了重組質粒的大腸桿菌菌株中，目的基因正常轉錄形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白質卻并不具有生物活性，最可能的原因是大腸桿菌細胞內缺乏內質網與高爾基體（或大腸桿菌缺乏生物膜系統），不能對多肽鏈進行折疊、組裝與修飾．

Answer 1

分析 分析題圖：外源DNA含有四個酶切位點，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位點位于目的基因上，所以不能用此酶切割；質粒也含有SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶的酶切位點，但用SmaⅠ酶切割會將質粒上兩個標記基因均破壞，所以不能用SmaⅠ酶切割；所以構建基因表達載體時，應選用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質粒和含目的基因的外源DNA．用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質粒，會破壞氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環素抗性基因，所以導入重組質粒的大腸桿菌能抗四環素，但不能抗癌變青霉素．

解答 解：（1）質粒上含有兩個SmaⅠ限制酶的切割位點，所以用SmaⅠ限制酶處理圖甲所示的質粒會得到2個DNA片段；圖乙所示的外源DNA含有一個AluⅠ限制酶的切割位點，所以用AluⅠ處理外源DNA會形成兩個黏性末端，增加2個游離的磷酸基團．
（2）外源DNA含有四個酶切位點，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位點位于目的基因上，所以不能用此酶切割；用SmaⅠ酶切割會將質粒上兩個標記基因均破壞，所以不能用SmaⅠ酶切割；應選用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質粒和含目的基因的外源DNA，這樣可以避免目的基因和質粒在酶切后產生的片段發生自身環化或任意連接，也便于篩選需要．如果是用PCR技術擴增目的基因，設計引物是關鍵，但在擴增時退火溫度一般為55～60℃，對于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%時一般用60℃，原因是G與C之間是三個氫鍵，所以C和G比例越高，DNA越穩定．
（3）用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質粒，會破壞氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環素抗性基因，所以導入重組質粒的大腸桿菌能抗四環素，但不能抗癌變青霉素．為了篩選獲得含有重組質粒的大腸桿菌，首先將經轉化處理過的大腸桿菌接種在含四環素的培養基中，然后用影印法將該培養基上的菌落按原來的方向印在含氯霉素培養基上，以篩選獲得含重組質粒的細菌．在含四環素培養基中能生長繁殖，而在含氯霉素培養基中不能生長繁殖的是導入了重組質粒的大腸桿菌．
（4）因為大腸桿菌細胞內缺乏內質網與高爾基體，不能對多肽鏈進行折疊、組裝與修飾，所以在上述導入了重組質粒的大腸桿菌菌株中，目的基因正常轉錄形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白質卻并不具有生物活性．
故答案為：
（1）2    2
（2）PstⅠ和HindⅢ酶      G與C（之間是三個氫鍵）比例越高越穩定[或A與T（之間是兩個氫鍵）比例越高越不穩定]
（3）四環素    氯霉素    重組質粒（或 目的基因）
（4）大腸桿菌細胞內缺乏內質網與高爾基體（或大腸桿菌缺乏生物膜系統），不能對多肽鏈進行折疊、組裝與修飾

點評 本題以圖為載體，考查基因工程的相關知識，意在考查考生分析題圖提取有效信息的能力；理解限制酶的作用特點，并結合圖解分析限制酶的作用結果；能運用所學知識，對生物學問題作出準確判斷和得出正確結論的能力．