Question

17．科學(xué)家將魚抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高．如圖是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖（amp^r為抗氨芐青霉素基因），其中PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ為限制酶切割位點，①～④是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程中的相關(guān)步驟．請據(jù)圖回答有關(guān)問題．

（1）在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，可用一種或多種限制酶進(jìn)行切割，在此實例中，為了避免目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接（或目的基因自連、質(zhì)粒自連），應(yīng)該選用限制酶PstⅠ、SmaⅠ，分別對含魚的抗凍蛋白基因的DNA、質(zhì)粒進(jìn)行切割．
（2）農(nóng)桿菌作為中間受體，重組質(zhì)粒如何進(jìn)入農(nóng)桿菌：先用Ca²⁺處理細(xì)胞，使細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)受體細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程．
（3）在組織培養(yǎng)過程中，除添加必要的營養(yǎng)物質(zhì)，還需要向培養(yǎng)基中添加植物激素（生長素和細(xì)胞分裂素），同時除提供適宜的溫度、光照和氧氣等環(huán)境條件外，成功的另一關(guān)鍵是無菌操作．
（4）將魚抗凍蛋白基因?qū)�入番茄�?xì)胞后，通常采用抗凍接種實驗，在個體水平上檢測目的基因是否翻譯形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)．

Answer 1

分析 分析圖解：魚的抗凍蛋白基因上具有三種限制酶切割位點，PstⅠ酶的切割位點存在于目的基因的兩側(cè)，SmaⅠ酶的切割位點存在于目的基因的左側(cè)，而AluⅠ酶的切割位點存在于目的基因的中央，因此不宜選用AluⅠ酶．質(zhì)粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四種限制酶切割位點，在選擇限制酶時一般選擇同種限制酶，以便形成相同的黏性末端．圖中①～④分別表示：基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、脫分化、再分化．

解答 解：（1）在構(gòu)建基因表達(dá)載體中，如果目的基因和載體用同一種限制酶切割，獲得的黏性末端相同，將會發(fā)生目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接（或目的基因自連、質(zhì)粒自連），故應(yīng)選用不同的限制酶分別對目的基因和載體切割，以獲得不同的黏性末端．由于AluⅠ酶的切割位點存在于目的基因的中央，因此不宜選用AluⅠ酶，則應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ對含魚抗凍蛋白基因的DNA、質(zhì)粒進(jìn)行切割．
（2）將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞需要采用感受態(tài)細(xì)胞法，即先用Ca²⁺處理細(xì)胞，使細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)受體細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程．
（3）在組織培養(yǎng)過程中，除添加必要的營養(yǎng)物質(zhì)，還需要向培養(yǎng)基中添加植物激素（生長素和細(xì)胞分裂素），同時除提供適宜的溫度、光照和氧氣等環(huán)境條件外，成功的另一關(guān)鍵是無菌操作．
（4）將魚抗凍蛋白基因?qū)�入番茄�?xì)胞后，通常采用抗凍接種實驗，在個體水平上檢測目的基因是否翻譯形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)．
故答案為：
（1）目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接（或目的基因自連、質(zhì)粒自連）    PstⅠ、SmaⅠ含魚的抗凍蛋白基因的DNA、質(zhì)粒
（2）重組表達(dá)載體DNA分子        溫度
（3）植物激素（生長素和細(xì)胞分裂素）    無菌操作
（4）抗凍接種

點評 本題具有一定的難度，屬于考綱中理解層次的要求，考查了基因工程的工具酶、目的基因?qū)�入受體細(xì)胞以及利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)知識，解答的難點是能夠根據(jù)目的基因和質(zhì)粒上的切割位點選擇合適的限制酶．