Question

5．基因工程
pUC18是基因工程中常用的質粒運載體，其結構如圖1（其中HindⅢ、PstⅠ、EcoRⅠ等限制酶的識別位點之間的堿基對數忽略不計，lacZ是顯色基因）．

現將擴增的含目的基因的外源DNA片段與pUC18質粒都用PstI進行酶切，然后用DNA連接酶進行連接，構建重組質粒．為篩選非重組子和重組子，分別用不同的限制酶進行酶切．經瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1（1kb=1000對堿基）．請據圖分析回答：
（1）與pUC18質粒重組的目的基因大小為4kb．
（2）用kpnⅠ酶切pUC18質粒，產生了1條2.7kb的帶；用kpnⅠ酶切重組質粒，產生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數據（圖2）．下列說法中合理的是AC（多選）
A．重組質粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點，且其中一個位于目的基因的區段
B．重組質粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點，都位于目的基因的區段
C．產生兩種酶切的結果，推測是目的基因與開環的pUC18拼接時有兩種可能的插入方向
D．產生兩種酶切的結果，推測是另有一種限制酶的酶切位點的堿基序列與kpnⅠ相同
（3）請在目的基因上標注kpnⅠ酶切位點（需注明目的基因的堿基對數量及kpnⅠ酶切位點兩側的堿基對數量）

（4）大腸桿菌pUC18質粒的LacZ基因中如果沒有插入外源基因，lacZ基因便可表達出β-半乳糖苷酶，當培養基中含有IPTG和X-gal時，X-gal便會被β-半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落．反之，則形成白色菌落．選擇培養基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養物質外，還應加X-gal、IPTG、氨芐青霉素入物質．成功導入重組質粒的大腸桿菌在培養基中形成白色顏色的菌落，原因是lacZ基因被插入目的基因而失活．

Answer 1

分析 分析題圖：用HindⅢ或EcoRⅠ切割后，pUC18質粒只產生1條2、7kb的帶，重組子產生了2條帶，即4.0kb和2.7kb，非重組子產生1條帶，即2.7kb．用kpnⅠ酶切pUC18質粒，產生了1條2.7kb的帶；用kpnⅠ酶切重組質粒，產生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數據，說明重組質粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點，且其中一個位于目的基因的區段，產生兩種酶切的結果的原因可能是目的基因與開環的pUC18拼接時有兩種可能的插入方向．據此答題．

解答 解：（1）根據圖1可知，pUC18質粒的長度是2.7kb，而重組子的長度是2.7+4.0=6.7kb，因此與pUC18質粒重組的目的基因大小為4kb．
（2）AB、pUC18質粒的長度是2.7kb，目的基因大小為4kb，用kpnⅠ酶切重組質粒，產生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數據，這說明重組質粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點，且其中一個位于目的基因的區段，A正確，B錯誤；
CD、產生兩種酶切的結果，推測是目的基因與開環的pUC18拼接時有兩種可能的插入方向，C正確，D錯誤．
故選：AC．
（3）用kpnⅠ酶切重組質粒，產生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數據，說明重組質粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點，且其中一個位于目的基因的區段，目的基因上標注kpnⅠ酶切位點如圖：．
（4）大腸桿菌pUC18質粒的LacZ基因中如果沒有插入外源基因，lacZ基因便可表達出β-半乳糖苷酶，當培養基中含有IPTG和X-gal時，X-gal便會被β-半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落．反之，則形成白色菌落．培養基中應含有大腸桿菌必需的營養物質包括碳源、氮源、無機鹽、水和生長因子．由于質粒上含有氨芐青霉素抗性基因，因此導入質粒的大腸桿菌能抗氨芐青霉素，所以培養基中還應加入氨芐青霉素，作用是篩選出導入pUC18質粒的大腸桿菌，此外培養基中還應加入IPTG、X-gal．重組質粒上的LacZ基因被破壞，不能產生β一半乳糖苷酶，若大腸桿菌中已成功導入了重組質粒，則其在含有IPTG和X-gal的培養基中形成白色菌落．
故答案為：
（1）4
（2）AC
（3）

（必須正確標出酶切位點距離一端的堿基數才給分，也可標于左側．）
（4）X-gal、IPTG、氨芐青霉素    白色    lacZ基因被插入目的基因而失活

點評 本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節問題，能正確分析題圖，并結合圖中信息準確答題，屬于考綱識記和理解層次的考查．