Question

14．請分析回答下列有關基因工程問題
胰島素A、B鏈分別表達法是生產胰島素的方法之一． 圖1是該方法所用的基因表達載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工  程菌生產人胰島素的基本流程（融合蛋白  A、B分別表示β-半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白）．

（1）圖1基因表達載體中沒有標注出來的基本結構是終止子．
（2）圖1中啟動子是RNA聚合 酶識別和結合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達；氨芐青霉素抗性基因的作用是作為標記基因，將含有重組質粒的大腸桿菌篩選出來．
（3）構建基因表達載體時必需的工具酶有限制酶和DNA連接酶．
（4）β-半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏在內部，其意義在于防止胰島素的A、B鏈被菌體內蛋白酶降解．
（5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β-半乳糖苷酶被切成多個肽段，這是因為β-半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸．
（6）根據圖2中胰島素的結構，請推測每個胰島素分子中所含游離氨基的數量．你的推測結果是至少2個，理由是兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸的R基中可能還含有游離的氨基．
（7）如果圖1所示的載體可被A、B、C三種限制性內切酶同時切割．單獨A切割得一條長鏈，單獨B切也得一條長鏈，A和C同時切割得2個500bp和1個2666bp片段，B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段．若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度為750bp，C的兩個切割位點與A點的最短距離分別為500bp、1000bp．
（8）如限制酶SmaI能識別如圖3的「5‘-CCCGGG-3’」6個堿基序列，并在中央（圖中箭頭位置）切斷DNA．則用限制酶SmaI處理如圖的線狀雙鏈DNA時，請以箭頭標出切割位置．

Answer 1

分析 基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）根據題意和圖示分析可知：圖1基因表達載體中已有目的基因、啟動子和標記基因，所以沒有標注出來的基本結構是終止子．
（2）圖1中啟動子是RNA聚合酶酶識別和結合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達即轉錄過程；氨芐青霉素抗性基因的作用是作為標記基因，將含有重組質粒的大腸桿菌篩選出來．
（3）構建基因表達載體的過程中，必須用相同的限制酶切割（含目的基因的外源DNA分子）和運載體，以產生相同的黏性末端，再加入DNA連接酶將目的基因和運載體連接形成重組DNA分子．
（4）β-半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏在內部，這樣可以防止胰島素的A、B鏈被菌體內蛋白酶降解．
（5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，由于β-半乳糖苷酶中含有多個甲硫氨酸，而胰島素的A、B鏈中不含甲硫氨酸，所以用溴化氰處理相應的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β-半乳糖苷酸被切成多個肽段．
（6）由于一個肽鏈中至少有一個游離的氨基和一個游離的羧基，在肽鏈內部的R基中可能也有氨基和羧基，而胰島素含有A鏈和B鏈，所以每個胰島素分子中所含游離氨基的數量至少是2個．
（7）分析題意可知，限制酶A和B在質粒上均只含有一個切割位點，限制酶C在質粒上有2個切割位點．由于B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段，說明限制酶B的切點在限制酶C的兩個短距離的切點之間，因此若以A的切割位點為計算起點，則B的切割位點與A點最短長度=500+250=750bp，則畫圖可知C的兩個切割位點與A點的最短距離分別為500bp、1000bp．
（8）分析圖解可知，限制酶SmaI能識別如圖3的「5‘-CCCGGG-3’」6個堿基序列，并在中央切斷DNA形成的平末端，因此它的切割位點為C和G之間．

故答案為：
（1）終止子   
（2）RNA聚合    作為標記基因，將含有重組質粒的大腸桿菌篩選出來
（3）限制酶和DNA連接酶
（4）防止胰島素的A、B鏈被菌體內蛋白酶降解
（5）β-半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸
（6）至少2個    兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸的R基中可能還含有游離的氨基
（7）750bp     500bp     1000bp 
（8）

點評 本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的操作工具及具體的操作步驟，掌握各步驟中的相關細節，能結合圖中信息準確答題，屬于考綱識記和理解層次的考查．