Question

8．pEZZ18表達(dá)載體可以利用蛋白質(zhì)A的信號(hào)肽將目標(biāo)蛋白分泌到細(xì)胞外，避免蛋白在胞內(nèi)被降解，利用Z基因產(chǎn)生的功能區(qū)蛋白進(jìn)行篩選．圖乙為pEZZ18表達(dá)運(yùn)載體模式圖，圖甲為目的基因示意圖．現(xiàn)有研究小組欲使用該運(yùn)載體生產(chǎn)甲肝疫苗（如下圖所示），據(jù)圖回答以下問(wèn)題．

（1）該實(shí)驗(yàn)的目的基因是甲肝病毒衣殼蛋白基因，運(yùn)載體酶切是選用的酶切位點(diǎn)是XbaI和PstI．酶切后應(yīng)用DNA連接酶連接目的基因和運(yùn)載體，已知經(jīng)酶切的目的基因大小為1415bp，則重組后的運(yùn)載體大小為6000bp．
（2）若需篩選帶有重組運(yùn)載體的細(xì)菌，則培養(yǎng)基中應(yīng)添加青霉素及與lac Z基因表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)的底物，目的菌株在平板中呈現(xiàn)白色．
（3）產(chǎn)生目的蛋白后，需進(jìn)行分離提純，下列對(duì)該蛋白分離純化過(guò)程描述正確的是BCD（多選）
A．分離純化過(guò)程需要進(jìn)行破碎細(xì)胞操作
B．可以通過(guò)加入硫酸銨的方式讓蛋白質(zhì)沉淀
C．可以通過(guò)層析的方式對(duì)蛋白進(jìn)行提純
D．分離過(guò)程需要考慮是否會(huì)使蛋白質(zhì)變性．

Answer 1

分析 分析甲圖：外源DNA分子中含有限制酶Xba I、Pst I和Sma I的切割位點(diǎn)，用限制酶Sma I切割會(huì)破壞目的基因，只用限制酶Xba I切割會(huì)導(dǎo)致目的基因與運(yùn)載體反向連接，因此為了防止目的基因與運(yùn)載體反向連接，對(duì)運(yùn)載體酶切時(shí)選用的酶切位點(diǎn)是XbaI和PstI．
分析乙圖：圖乙為pEZZ18表達(dá)載體，該表達(dá)載體可以利用蛋白質(zhì)A的信號(hào)肽將目標(biāo)蛋白分泌到細(xì)胞外，避免蛋白在胞內(nèi)被降解，利用Z基因產(chǎn)生的功能區(qū)蛋白進(jìn)行篩選（lacZ基因表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，目的基因插入后lacZ基因無(wú)法表達(dá)，菌落呈白色）．

解答 解：（1）由圖甲可知，該實(shí)驗(yàn)的目的基因是甲肝病毒衣殼蛋白基因；外源DNA分子中含有限制酶Xba I、Pst I和Sma I的切割位點(diǎn)，用限制酶Sma I切割會(huì)破壞目的基因，只用限制酶Xba I切割會(huì)導(dǎo)致目的基因與運(yùn)載體反向連接，因此為了防止目的基因與運(yùn)載體反向連接，對(duì)運(yùn)載體酶切時(shí)選用的酶切位點(diǎn)是XbaI和PstI．酶切后應(yīng)用DNA連接酶連接目的基因和運(yùn)載體；運(yùn)載體也用限制酶XbaI和PstI切割，已知經(jīng)酶切的目的基因大小為1415bp，則重組后的運(yùn)載體大小為4591+1415-6（運(yùn)載體中限制酶XbaI和PstI之間有6個(gè)堿基）=6000bp．
（2）標(biāo)記基因是青霉素抗性基因，因此要需篩選帶有重組運(yùn)載體的細(xì)菌，則培養(yǎng)基中應(yīng)添加青霉素及與lac Z基因表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)的底物，目的基因插入后lacZ基因無(wú)法表達(dá)，菌落呈白色．
（3）A．由于蛋白質(zhì)A的信號(hào)肽將目標(biāo)蛋白分泌到細(xì)胞外，因此分離純化過(guò)程不需要進(jìn)行破碎細(xì)胞操作，A錯(cuò)誤；
B．可以通過(guò)加入硫酸銨的方式讓蛋白質(zhì)沉淀，B正確；
C．可以通過(guò)層析的方式對(duì)蛋白進(jìn)行提純，C正確；
D．蛋白質(zhì)的活性易受溫度等因素的影響，因此分離過(guò)程需要考慮是否會(huì)使蛋白質(zhì)變性，D正確．
故選：BCD．
故答案為：
（1）甲肝病毒衣殼蛋白基因   Xba I    Pst I   DNA連接酶   6000   
（2）青霉素    白  
（3）BCD

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、操作工具及操作步驟，能結(jié)合圖中和題中信息準(zhǔn)確答題，屬于考綱理解和應(yīng)用層次的考查．