Question

20．回答下列關于基因工程的問題．
外源基因需要導入受體細胞才能實現其表達功能．下圖示一種外源基因導入受體細胞的方法，請據圖分析回答：

（1）圖所示的導入方法稱為顯微注射法．在動物基因工程中，受體細胞通常采用受精卵．
基因工程操作步驟中，需要從受體細胞群中篩選出已獲得目的基因的細胞，下圖①-③示一種篩選方法的過程．
pBR322質粒含有兩個抗性基因，分別是Amp（氨芐青霉素）抗性基因和Tet（四環素）抗性基因，其中在Tet抗性基因上有下列目的基因的插入位點（插入將導致Tet抗性基因功能性失活），請據圖分析回答：

（2）圖中①過程所需的酶是DNA連接酶（DNA連接酶和限制酶）．
（3）經過①過程，pBR322質粒可能出現的兩種結果A是目的基因成功插入（重組質粒）、目的基因插入不成功（沒有發生重組的質粒）．
（4）②過程表示用含四環素（使細胞停止生長，但不致死）和環絲氨酸（使生長的細胞致死）的培養基中培養細菌甲，則培養結果C表示在培養基中可能存活的細菌包括導入不成功的細菌和導入了重組質粒的細菌．
（5）若要進一步篩選出符合要求的受體細胞D，則③過程需要做的處理是（請參照過程②的方法）將存活的細菌轉移到含氨芐青霉素的培養基上培養．
基因工程中使用的Ⅱ型限制性核酸內切酶通常可以識別長度為4-8個核苷酸的特異序列．下列圖示限制酶Sau3AⅠ對DNA片段切割的結果．

（6）請據圖分析，Sau3AⅠ的識別序列以及切割位點（用“↓”表示）是↓GATC．
下表列出了幾種限制酶的識別序列及其切割位點，圖1（含兩個抗性基因的質粒）和圖2（含目的基因的外源DNA）中箭頭表示相關限制酶的酶切位點，請據圖分析回答：

限制酶	XhoⅠ	BclⅠ	SalⅠ	BamHⅠ	XbaⅠ
識別序列及酶切位點	C↓TCGAG	T↓GATCA	G↓TCGAC	G↓GATCC	T↓CTAGA

（7）為了使目的基因和質粒實現定向連接和便于受體細胞的篩選，切割質粒的限制酶應選用XbaⅠ和BamHⅠ，切割含目的基因的外源DNA的酶應選用XbaⅠ和BclⅠ．

Answer 1

分析 基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；在動物基因工程中，受體細胞通常采用受精卵，因為受精卵的全能性最高．
（2）圖中①表示基因表達載體的構成過程，該過程首先需要采用限制酶切割外源DNA分子和運載體，其次還需要用DNA連接酶將目的基因和運載體連接形成重組DNA分子．
（3）經過①過程，pBR322質粒可能出現的兩種結果A，即目的基因成功插入（重組質粒）、目的基因插入不成功（沒有發生重組的質粒）．
（4）構建基因表達載體時，四環素抗性基因被破壞，因此②過程中用含四環素（使細胞停止生長，但不致死）和環絲氨酸（使生長的細胞致死）的培養基中培養細菌甲時，則培養結果C表示在培養基中可能存活的細菌包括導入不成功的細菌和導入了重組質粒的細菌．
（5）構建基因表達載體時，氨芐青霉素抗性基因沒有被破壞，因此若要進一步篩選出符合要求的受體細胞D，則③過程需要將存活的細菌轉移到含氨芐青霉素的培養基上培養．
（6）由圖可知，Sau3AⅠ的識別序列以及切割位點是↓GATC．
（7）目的基因上有限制酶BamHⅠ的切割位點，則不能用該酶切割外源DNA分子，因此為了使目的基因和質粒實現定向連接和便于受體細胞的篩選，切割含目的基因的外源DNA的酶應選用XbaⅠ和BclⅠ；由于BclⅠ和BamHⅠ切割后產生的黏性目的相同，因此切割質粒的限制酶應選用XbaⅠ和BamHⅠ．
故答案為：
（1）顯微注射法    受精卵
（2）DNA連接酶（DNA連接酶和限制酶）
（3）目的基因成功插入（重組質粒）       目的基因插入不成功（沒有發生重組的質粒）
（4）導入不成功的細菌和導入了重組質粒的細菌
（5）將存活的細菌轉移到含氨芐青霉素的培養基上培養
（6）↓GATC
（7）XbaⅠ和BamHⅠXbaⅠ和BclⅠ

點評 本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節問題，能結合圖中信息準確答題，屬于考綱理解和應用層次的考查，有一定難度．