Question

5．在農業生產中發現一種廣泛使用的除草劑（含氮有機化合物）在土壤中不易降解，長期使用可污染土壤．為修復被該除草劑污染的土壤，可按下面程序選育能降解該除草劑的細菌（已知該除草劑在水中溶解度低，含一定量該除草劑的培養基不透明）．

（1）制備土壤浸出液時，為避免菌體濃度過高，需將浸出液進行稀釋處理．現有1L土壤浸出液，用無菌吸管吸取1mL樣液至盛有9mL無菌水的試管中，依次稀釋10³稀釋度．各取0.1mL已稀釋10³倍的水樣分別接種到三個培養基上培養，記錄的菌落數分別為55、56、57，則每升原土壤浸出液樣中菌體數為5.6×10⁸．
（2）要從長期使用該除草劑的土壤中分離目的菌，從用途方面來看，上述培養皿中培養基的成分特點是在無氮培養基中添加了該除草劑．
（3）接種技術的核心是防止雜菌污染，保證培養物的純度，是研究和應用微生物的前提．在劃線接種時，連續劃線的目的是將聚集的菌種逐步稀釋獲得單個菌落，培養時，只有很少菌落出現，大部分細菌在此培養基上不能生長的主要原因是培養基中缺少這些細菌可利用的氮源或有氧條件抑制了這些細菌的生長．
（4）在培養基上形成的菌落中，無透明帶菌落利用的氮源主要是氮氣，有透明帶菌落利用的氮源主要是該除草劑，據此可篩選出目的菌．實驗結果如圖2顯示的A～E五種菌株中，E是最理想菌株．
（5）科研人員用放射線處理該細菌獲得兩個突變株A和B，然后對突變株A和B進行實驗，結果如表所示：

接種的菌種	一般培養基	實驗處理及結果
A	不生長	添加營養物質甲，能生長
B	不生長	添加營養物質乙，能生長
A+B	能生長	不添加營養物質甲、乙就能生長

突變株A不能在一般培養基上生長的原因是突變株A缺乏合成營養物質甲所需要的酶．突變株A和B混合在一起接種于一般培養基中能生長的最可能原因是突變株A生長需要營養物質甲，突變株B可以提供；突變株B生長需要營養物質乙，突變株A可以提供．

Answer 1

分析 1、從土壤中分離微生物的一般步驟是：土壤取樣、選擇培養、梯度稀釋、涂布培養和篩選菌株．
2、從土壤中分離目的菌要用固體的選擇培養基，在固體培養基中，無透明帶菌落利用的氮源主要是氮氣；有透明帶菌落利用的氮源主要是除草劑，據此可篩選出目的菌．

解答 解：（1）各取0.1mL已稀釋10³倍的水樣分別接種到三個培養基上培養，記錄的菌落數分別為55、56、57，則每升（1L等于10³ml）原土壤浸出液樣中菌體數為$\frac{55+56+57}{3}$×10³×10⁴=5.6×10⁸．
（2）從物理性質方面來看，題圖培養皿中培養基屬于固體培養基；從用途方面來看，該培養皿中培養基屬于選擇培養基．該除草劑為含氮有機化合物，降解該除草劑的細菌可以以除草劑為氮源．故該培養基中除加入除草劑外，不再含有其他氮源，以選擇出能降解該除草劑的細菌．
（3）接種技術的核心是防止雜菌污染，保證培養物的純度，是研究和應用微生物的前提．在劃線接種時，連續劃線的目的是將聚集的菌種逐步稀釋獲得單個菌落；培養時，只有很少菌落出現，大部分細菌在此培養基上不能生長的主要原因是培養基中缺少這些細菌可利用的氮源或有氧條件抑制了這些細菌的生長．
（4）在培養基上形成的菌落中，無透明帶菌落利用的氮源主要是氮氣，有透明帶菌落利用的氮源主要是該除草劑，且透明圈越大，該細菌降解除草劑的能力越強，因此圖2顯示的A～E五種菌株中，E是最理想菌株．
（5）突變株A的生長依賴于營養物質甲，突變株B的生長依賴于營養物質乙．不添加營養物質甲和乙，二者混合培養時都能生長，最可能的原因是突變株A為突變株B提供了營養物質乙，突變株B為突變株A提供了營養物質甲．
故答案為：
（1）5.6×10⁸
（2）在無氮培養基中添加了該除草劑 
（3）防止雜菌污染，保證培養物的純度        稀釋獲得單個菌落        培養基中缺少這些細菌可利用的氮源
（4）氮氣  該除草劑       E
（5）突變株A缺乏合成營養物質甲所需要的酶           突變株A生長需要營養物質甲，突 變株B可以提供；突變株B生長需要營養物質乙，突變株A可以提供

點評 本題考查微生物培養的實驗，解答此類題目的關鍵是對土壤中微生物的分離與計數這個實驗的熟練掌握，和在微生物實驗中的無菌操作相關知識的熟練應用．