Question

下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導入巴斯德畢赤酵母菌生產乙肝疫苗的過程及有關資料，請分析回答下列問題．

資料1：巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，同時AOX1基因能受甲醇誘導而表達【5′AOX1和3′AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子】．
資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內無天然質粒，所以科學家改造出了圖1所示的pPIC9K質粒用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現表達．
（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接上

 

、

 

限制酶識別序列，這樣設計的優點是

 

．
（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用

 

將其連接到pPIC9K質粒上，形成重組質粒，并將其導入大腸桿菌以獲取

 

．
（3）步驟3中應選用限制酶

 

來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞．
（4）為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養基中應該加入

 

以便篩選，轉化后的細胞中是否含有HBsAg基因，可以用分子雜交方法進行檢測．
（5）轉化的酵母菌在培養基上培養一段時間后，需要向其中加入

 

以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達．
（6）與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優點是在蛋白質合成后，細胞可以對其進行

 

并分泌到細胞外，便于提取．
（7）若某種限制酶切割DNA分子后形成的粘性末端為則該酶識別的核苷酸序列是

 

．

Answer 1

考點：基因工程的應用

專題：

分析：分析題圖：圖中質粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點，其中SacI位于啟動子上，BglⅡ位于終止子上．要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質粒，要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應選用限制酶BglⅡ來切割．5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培養基中加入卡那霉素以便篩選導入重組質粒的目的菌．

解答： 解：（1）圖中質粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點，其中SacI位于啟動子上，BglⅡ位于終止子上．如果要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質粒，所以應在HBsAg基因兩側的A和B位置接上SnaB、AvrⅡ限制酶識別序列．這兩種酶切割產生的黏性末端不同，這樣可以避免質粒和目的基因自身環化，還可以防止目的基因和質粒反向連接．
（2）獲取目的基因后，需要用DNA連接酶將目的基因和運載體連接形成重組質粒，并將其導入大腸桿菌以獲取大量重組質粒．
（3）步驟3是要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應選用限制酶BglⅡ來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞．
（4）5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，則導入重組質粒的大腸桿菌能抗卡那霉素，所以為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養基中應該加入卡那霉素以便篩選．轉化后的細胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子雜交方法進行檢測．
（5）巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，同時甲醇能誘導AOX1基因表達．所以轉化的酵母菌在培養基上培養一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達．
（6）細菌是原核生物，只含核糖體一種細胞器，而酵母菌是真核生物，除含有核糖體外，還含有內質網、高爾基體等細胞器．所以與細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優點是在蛋白質合成后，細胞可以對其進行加工（修飾）并分泌到細胞外，便于提取．
（7）限制酶識別的序列一般是回文系列，若某種限制酶切割DNA分子后形成的粘性末端為，則該酶識別的核苷酸序列是GACGTC．
故答案：（1）SnaB   AvrⅡ避免質粒和目的基因自身環化；
（2）DNA連接酶     大量重組質粒
（3）BglⅡ
（4）卡拉霉素
（5）甲醇
（6）加工（修飾）
（7）GACGTC

點評：本題結合工程菌形成過程，考查基因工程的相關知識，意在考查考生分析題圖獲取有效信息的能力；理解所學知識要點，把握知識間聯系的能力；能運用所學知識解決生物學問題的能力和應用能力．