Question

12．凝乳酶是奶酪生產中的關鍵性酶．直接利用動、植物生產凝乳酶受多種因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌種是目前最有前途的發展方向．用紫外線照射芽孢桿菌，分離、培養，并檢測各菌株所產生的凝乳酶活力．操作過程如圖1所示．請分析回答：

（1）圖1所示的b過程的目的是為獲得單個菌落，接種用的平板培養基不是（是/不是）選擇培養基．
（2）在一定溫度下（35℃），一定時間內（通常為40分鐘），凝固1mL10%脫脂奶粉的酶量為一個酶活力單位（U）．凝乳酶活力檢測結果如圖2所示．
①據圖2所示，酶催化能力最強的是A₆組．
②A₂、A₅組酶活力與A₀組芽孢桿菌相同，兩位同學對此做出了推測：
同學甲：A₂、A₅組芽孢桿菌未發生基因突變，而其他組發生的變化說明基因突變
具有不定向的特點．
同學乙：A₂、A₅組芽孢桿菌發生基因突變，但凝乳酶蛋白未改變，其依據的理由是一種氨基酸可能對應多種密碼子（基因突變發生在非編碼區）．為了驗證上述2位同學的假設，可采用DNA分子雜交（DNA測序）技術檢測凝乳酶基因是否發生了突變．
（3）從牛胃液中分離到的凝乳酶以催化能力強而被廣泛應用，研究人員運用基因工程技術，將編碼該酶的基因轉移到了微生物細胞中．
①從牛胃細胞中提取mRNA，再逆轉錄形成cDNA．以此cDNA為模板PCR擴增目的基因．
②構建重組DNA分子（如圖3所示）最好選用BamHI和PstI限制酶．
③研究發現，如果將該凝乳酶20位和24位氨基酸改變為半胱氨酸，其催化能力將提高2倍．通過蛋白質工程生產高效凝乳酶，所需步驟有b、a、d、e（選擇對即可得分，不要求排序）．
a．蛋白質的結構設計                  b．蛋白質的結構和功能分析
c．蛋白質結構的定向改造               d．凝乳酶基因的定向改造
e．將改造后的凝乳酶基因導入受體細胞     f．將定向改造的凝乳酶導入受體細胞．

Answer 1

分析 據圖分析：圖1所示的b過程為菌落的稀釋，培養基中含有多種酶活力不同的突變芽孢桿菌．圖2中，凝固1mL10%脫脂奶粉的酶量最少的是6組．由圖3可知，質粒和外源DNA中共同含有且不會破壞目的基因的限制酶是BamHI和PstI．

解答 解：（1）圖1所示的b過程為菌落的稀釋，目的是為獲得單個菌落；由圖可知培養基中含有多種酶活力不同的突變芽孢桿菌，故接種用的平板培養基不是選擇培養基．
（2）①據圖2所示，凝固1mL10%脫脂奶粉的酶量最少的是A₆組，故酶催化能力最強的是A6組．②同學甲：A₂、A₅組芽孢桿菌未發生基因突變，而其他組發生的變化說明基因突變具有不定向性的特點．同學乙：如果A₂、A₅組芽孢桿菌發生基因突變，但凝乳酶蛋白未改變，這可能是因為一種氨基酸可能對應多種密碼子，隨基因發生突變，但不會改變翻譯出來的氨基酸；也可能是因為發生基因突變的區段為非編碼區．為了驗證上述2位同學的假設，可采用DNA分子雜交技術檢測凝乳酶基因是否發生了突變．
（3）①牛胃細胞中含有能翻譯出凝乳酶的mRNA，可逆轉錄得到cDNA．構建重組DNA分子時，需用同種限制性內切酶處理目的基因和載體，故需要在引物的5，端設計限制酶識別序列，以便構建重組DNA分子．
②由圖3可知，質粒和外源DNA中共同含有且不會破壞目的基因的限制酶是BamHI和PstI，因此構建重組DNA分子最好選用BamHI和PstI限制酶，這樣可以防止自身的黏性末端連接，防止目的基因與載體反向連接．
③通過分析想要的蛋白質的功能，預測蛋白質應有的結構，然后根據蛋白質的結構逆向推測控制該蛋白質合成的基因的堿基組成及排列順序．最后就是將改造后的目的基因導入受體細胞，從而轉錄翻譯得出目的蛋白．
故答案為：
（1）單個菌落       不是
（2）①A₆
②不定向
一種氨基酸可能對應多種密碼子（基因突變發生在非編碼區）
DNA分子雜交（DNA測序）
（3）①mRNA
②BamHI和PstI
③b、a、d、e

點評 本題結合圖示主要考查基因工程的原理及技術基因工程的應用蛋白質工程，意在強化相關知識的識記、理解與運用．