Question

16．Rag₂基因缺失小鼠不能產生成熟的淋巴細胞．科研人員利用胚胎干細胞（ES細胞）對Rag₂基因缺失小鼠進行基因治療．其技術流程如圖：

（1）步驟①中所選的卵母細胞應處于減數第二次分裂中期．
（2）步驟②中，重組胚胎培養到囊胚期時，可從其內細胞團分離出ES細胞，ES細胞在形態上表現為細胞體積小，細胞核大，核仁明顯的特點．
（3）步驟③中，需要構建含有Rag₂基因的表達載體．可以根據Rag₂基因的核苷酸序列設計合成引物，利用PCR技術技術擴增Rag₂基因片段．用HindⅢ和PstⅠ限制酶分別在目的基因所在DNA片段兩側進行酶切獲得Rag₂基因片段．為將該片段直接連接到表達載體，所選擇的表達載體上應具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位點．
（4）為檢測Rag₂基因的表達情況，可提取治療后小鼠骨髓細胞的蛋白質，用抗Rag₂蛋白的抗體進行雜交．

Answer 1

分析 1、動物核移植的概念：將動物的一個細胞的細胞核移入一個去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發育為動物個體．
2、胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內細胞團）．
3、在基因工程中，目的基因和質粒需要用同種限制酶進行切割，形成相同的黏性末端，再用DNA連接酶連接成重組質粒．
4、目的基因分子水平上的檢測：
①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術
②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術
③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術

解答 解：（1）步驟①核移植中所選的卵母細胞應處于減數第二次分裂中期．
（2）胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內細胞團）．故步驟②中，重組胚胎培養到囊胚期時，可從其內細胞團分離出ES細胞，ES細胞在形態上表現為細胞體積小，細胞核大，核仁明顯的特點．
（3）步驟③中，需要構建含有Rag₂基因的表達載體，設計引物要遵循堿基互補配對原則，所以根據Rag₂基因的核苷酸序列進行設計．Rag₂基因是利用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割獲得的，所以表達載體應具有HindⅢ和PstⅠ的酶切位點．
（4）基因表達的產物是蛋白質，所以提取小鼠骨髓細胞的蛋白質進行抗原-抗體雜交．
故答案為：
（1）減數第二次分裂中
（2）內細胞團   細胞體積小，細胞核大，核仁明顯
（3）表達載體  引物  PCR   HindⅢ和PstⅠ
（4）雜交

點評 題以基因治療的流程圖為載體，考查了基因工程、細胞工程以及胚胎工程等方面的知識，難度適中．考生要能夠識記細胞核移植的過程；識記囊胚包括內細胞團和滋養層兩部分；明確基因工程中質粒和目的基因需要利用同種限制酶進行切割；掌握目的基因檢測和鑒定的一般方法等．