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I 已知SARS是由一種RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康復(fù)后的血清中有抗S蛋白的特異性抗體。某研究小組為了研制預(yù)防SARS病毒的疫苗，開(kāi)展了前期研究工作。其簡(jiǎn)要的操作流程如下：

（1）實(shí)驗(yàn)步驟①所代表的反應(yīng)過(guò)程是             。

（2）步驟②構(gòu)建重組表達(dá)運(yùn)載體A和重組表達(dá)運(yùn)載體B必須使用限制性內(nèi)切酶和

          酶，后者的作用是將用限制性內(nèi)切酶切割的            和          連接起來(lái)。

（3）如果省略步驟②而將大量擴(kuò)增的S基因直接導(dǎo)入大腸桿菌，一般情況下，不能得到表達(dá)的S蛋白，其原因是S基因在大腸桿菌中不能              ，也不能            。

（4）為了檢驗(yàn)步驟④所表達(dá)的S蛋白是否與病毒S蛋白有相同的免疫反應(yīng)特性，可用

                與                  進(jìn)行抗原―抗體特異性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，從而得出結(jié)論。

II． 1958年，Meselson和Stahl通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)首次證明了DNA的半保留復(fù)制，此后科學(xué)家便開(kāi)始了有關(guān)DNA復(fù)制起點(diǎn)數(shù)目、方向等方面的研究。試回答下列問(wèn)題：

（1）由于DNA分子呈___________結(jié)構(gòu)，DNA復(fù)制開(kāi)始時(shí)首先必需解旋從而在復(fù)制起點(diǎn)位置形成復(fù)制叉（如圖1）。因此，研究中可以根據(jù)復(fù)制叉的數(shù)量推測(cè)___________________。

（2）1963年Cairns將不含放射性的大腸桿菌（擬核DNA呈環(huán)狀）放在含有³H-胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)一步證明了DNA的半保留復(fù)制。根據(jù)右邊的大腸桿菌親代環(huán)狀DNA示意圖，在答題紙的相應(yīng)方框內(nèi)用簡(jiǎn)圖表示復(fù)制一次和復(fù)制兩次后形成的DNA分子。（注：以“……”表示含放射性的脫氧核苷酸鏈）。

（3）DNA的復(fù)制從一點(diǎn)開(kāi)始以后是單向還是雙向進(jìn)行的，用不含放射性的大腸桿菌DNA放在含有³H-胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，給以適當(dāng)?shù)臈l件，讓其進(jìn)行復(fù)制，得到圖3所示結(jié)果，這一結(jié)果說(shuō)明________________。

（4）為了研究大腸桿菌DNA復(fù)制是單起點(diǎn)復(fù)制還是多起點(diǎn)復(fù)制，用第（2）題的方法，觀察到的大腸桿菌DNA復(fù)制過(guò)程如圖4所示，這一結(jié)果說(shuō)明大腸桿菌細(xì)胞中DNA復(fù)制是            起點(diǎn)復(fù)制的。

7．將動(dòng)物致病菌的抗原基因?qū)�入馬鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動(dòng)物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過(guò)程相關(guān)的圖和表。

表1   引物對(duì)序列表

表2  幾種限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)數(shù)

請(qǐng)根據(jù)以上圖表回答下列問(wèn)題。

（1）在采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點(diǎn)是__________。

（2）PCR過(guò)程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來(lái)設(shè)定。表1根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物序列，圖2為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖。請(qǐng)判斷哪一對(duì)引物可采用較高的退火溫度？________________________________________。

（3）圖1步驟3所用的DNA連接酶對(duì)所連接的DNA兩端堿基序列是否有專一性要求？                            

（4）PCR反應(yīng)中由堿基錯(cuò)配引起的變異來(lái)源于__________。假設(shè)對(duì)一個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，第一次循環(huán)時(shí)某一模板鏈上發(fā)生堿基錯(cuò)配，則擴(kuò)增若干次后檢測(cè)所有DNA的擴(kuò)增片段與原DNA相應(yīng)片段相同的是__________。

（5）對(duì)符合設(shè)計(jì)要求的重組質(zhì)粒T進(jìn)行酶切，假設(shè)所用的酶均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開(kāi)，請(qǐng)根據(jù)圖1中標(biāo)示的酶切位點(diǎn)和表2所列的識(shí)別序列，對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷。

①采用EcoRI和PstI酶切，得到__________種DNA片段。

②采用EcoRI和SmaI酶切，得到__________種DNA片段。

mtDNA是存在于人類細(xì)胞線粒體中雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子，具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和控制合成蛋白質(zhì)的功能。mtDNA的類型具有明顯的種族特異性。若用兩種識(shí)別切割序列完全不同的限制酶M和N切割某人的mtDNA，通過(guò)凝膠電泳分離分析得下表。限制酶M和N的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。

⑴．該mtDNA的長(zhǎng)度為_(kāi)__________kb。在該DNA分子中，M酶與N酶的切割位點(diǎn)分別有____________個(gè)。

⑵．M酶與N酶切出的能相互粘連的末端能在______________酶的作用下相互連接，請(qǐng)將連接的結(jié)果表示出來(lái)：_______________________。連接后的序列是否可以用M酶、N酶進(jìn)行切割，并簡(jiǎn)述理由：_________________________________________________

⑶．有人認(rèn)為mtDNA能成為研究人類起源與進(jìn)化的一個(gè)有力工具，請(qǐng)簡(jiǎn)述理由：_________________________________________________________________________ 。

下圖為真核細(xì)胞的某基因的結(jié)構(gòu)圖以及限制酶M和N的切割位點(diǎn)。

⑷．現(xiàn)用該基因作為目的基因，若采用直接從供體細(xì)胞中分離，具體方法是：_____________。這個(gè)方法雖操作方便，但切割下的基因中含有不能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的區(qū)域。因此，目前往往采用逆轉(zhuǎn)錄的人工合成的方法，其基本步驟是：__________________________。

⑸．已知Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個(gè)，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個(gè)，空白區(qū)域中G和C的總數(shù)共有400個(gè)，則由該區(qū)轉(zhuǎn)錄的mRNA中A和U總數(shù)是               。

（10分）mtDNA是存在于人類細(xì)胞線粒體中雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子，具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和控制合成蛋白質(zhì)的功能。mtDNA的類型具有明顯的種族特異性。現(xiàn)用兩種限制性核酸內(nèi)切酶M和N切割某人的mtDNA（限制酶M和N的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖1所示），然后通過(guò)凝膠電泳分離DNA片段（通電狀態(tài)下，不同分子量的DNA片段在瓊脂中的移動(dòng)距離不同從而被分離），分析后得到下表。

（1）該mtDNA的長(zhǎng)度為_(kāi)__________kb。在該DNA分子中，M酶與N酶的切割位點(diǎn)分別有____________個(gè)。

（2）M酶與N酶切出的能相互粘連的末端能在______________酶的作用下相互連接，請(qǐng)將連接的結(jié)果表示出來(lái)：_______________________。連接后的序列是否可以用M酶、N酶進(jìn)行切割，請(qǐng)簡(jiǎn)述理由：________________________________________。

（3）圖2為真核細(xì)胞的某基因的結(jié)構(gòu)圖以及限制酶M和N的切割位點(diǎn)。現(xiàn)用酶切法直接從供體細(xì)胞中切割圖2中的基因從而獲得目的基因，可選用酶______來(lái)切割。這個(gè)方法雖然操作方便，但切割下的基因中含有不能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的區(qū)域。因此，目前往往采用逆轉(zhuǎn)錄的人工合成的方法，其基本步驟是：__________________。

圖2

（4）已知圖2中Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個(gè)，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個(gè)，空白區(qū)域中G 和C的總數(shù)共有400個(gè)，則由該區(qū)轉(zhuǎn)錄的mRNA中A和U總數(shù)是_____________。

綠色熒光蛋白GFP能在藍(lán)光或紫外光的激發(fā)下發(fā)出熒光，這樣借助GFP發(fā)出的熒光就可以跟蹤蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)部的移動(dòng)情況，幫助推斷蛋白質(zhì)的功能。下圖為我國(guó)首例綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因克隆豬的培育過(guò)程示意圖，據(jù)圖回答：

（1）若限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G^↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—^↓GATC—，在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)，在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來(lái)__________，理由是： ___________________________________________。

（2）過(guò)程③將重組質(zhì)粒導(dǎo)入豬胎兒成纖維細(xì)胞時(shí)，采用最多的方法是______________________。

（3）獲得轉(zhuǎn)基因豬的關(guān)鍵步驟是_____（填序號(hào)），GFP基因的作用是作為_______。抑制小豬抗原表達(dá)的基因要插入到啟動(dòng)子和_________之間。獲得的轉(zhuǎn)基因克隆豬，可以解決的醫(yī)學(xué)難題是可以避免     _____________________。

（4）目前科學(xué)家們通過(guò)蛋白質(zhì)工程制造出了藍(lán)色熒光蛋白，黃色熒光蛋白等，采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造出藍(lán)色熒光蛋白過(guò)程的正確順序是：_____________________（用數(shù)字表示）。

①推測(cè)藍(lán)色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸

②藍(lán)色熒光蛋白的功能分析和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)序列

③藍(lán)色熒光蛋白基因的修飾（合成）  

④表達(dá)出藍(lán)色熒光蛋白。