Question

18．苜蓿夜蛾是番茄的主要害蟲之一．某實驗室將抗蟲基因轉入番茄，培育出抗蟲番茄．如圖是獲得轉基因番茄的技術流程[注：卡那霉素抗性基因（kan^R）作為標記基因，番茄葉片對卡那霉素高度敏感]，請據圖回答：

（1）構建重組質粒的過程中需要用到的工具酶為限制性核酸內切酶和DNA連接酶；DNA連接酶根據來源分為兩類：T₄DNA連接酶和E•coli DNA連接酶．這兩種酶作用有所差別：E•coliDNA連接酶只能連接雙鏈DNA的黏性末端，而T₄DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA的齊平末端．
（2）土壤農桿菌的感染特點是能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力．
（3）將重組質粒導入土壤農桿菌的目的是利用農桿菌能夠感染番茄細胞，并將T-DNA轉移至受體細胞的特點，使目的基因進入受體細胞中，并插入到番茄細胞的DNA上，最終形成轉基因植株．
（4）將經過脫分化形成的愈傷組織轉移到添加一定濃度植物激素和卡那霉素的培養基中，在適宜條件下進行培養，篩選出轉基因番茄．
（5）用PCR方法檢測轉基因番茄是否含有目的基因時，需根據抗蟲基因（目的基因）的核苷酸序列設計特異引物，以轉基因番茄的DNA（或“含目的基因的番茄DNA”）為模板進行第一輪擴增．

Answer 1

分析 基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法（原理：農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上．根據農桿菌的這一特點，如果將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上．）、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）構建重組質粒的過程中需要用到的工具酶為限制性核酸內切酶（切割含有目的基因的外源DNA分子和質粒）和DNA連接酶（將目的基因和質粒連接形成重組質粒）；DNA連接酶根據來源分為兩類：T₄DNA連接酶和E•coli DNA連接酶，其中E•coliDNA連接酶只能連接雙鏈DNA的黏性末端，而T₄DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA的齊平末端．
（2）土壤農桿菌的感染特點是能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力．
（3）將重組質粒導入土壤農桿菌的目的是利用農桿菌能夠感染番茄細胞，并將T-DNA 轉移至受體細胞的特點，使目的基因進入受體細胞中，并插入到番茄細胞的DNA上，最終形成轉基因植株．
（4）愈傷組織是經過脫分化過程形成的；由圖可知，標記基因是卡那霉素抗性基因，因此將形成的愈傷組織轉移到添加一定濃度植物激素和卡那霉素的培養基中，在適宜條件下進行培養，篩選出轉基因番茄．
（5）用PCR方法檢測轉基因番茄是否含有目的基因時，需根據抗蟲基因（目的基因）的核苷酸序列設計特異引物，以轉基因番茄的DNA（或“含目的基因的番茄DNA”）為模板進行第一輪擴增．
故答案為：
（1）限制性核酸內切酶     E•colDNA連接酶    T₄DNA連接酶
（2）雙子葉    單子葉
（3）T-DNA    DNA
（4）脫分化    卡那霉素
（5）抗蟲基因（目的基因）    轉基因番茄的DNA（或“含目的基因的番茄DNA”）

點評 本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節問題，能結合所學的知識準確答題，屬于考綱識記和理解層次的考查．