Question

下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圈l、圈2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點．請回答下列問題：

（1）一個如圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割前后，分別含有

 

個游離的磷酸基團．
（2）若對圖中質粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質粒的熱穩定性越

 

．
（3）用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是

 

．
（4）與只使用EcoR I相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點在于可以防止

 

．
（5）為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入

 

酶．
（6）重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了

 

．
（7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在

 

的培養基中培養，以完成目的基因表達的初步檢測．

Answer 1

考點：基因工程的原理及技術

專題：

分析：第一步：目的基因的獲取
（1）目的基因是指：編碼蛋白質的結構基因．
（2）原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成．人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法和化學合成法．
（3）PCR技術擴增目的基因
①原理：DNA雙鏈復制
②過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成．
第二步：基因表達載體的構建
（1）目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用．
（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因
①啟動子：是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質．
②終止子：也是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的尾端．
③標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來．常用的標記基因是抗生素基因．
第三步：將目的基因導入受體細胞
（1）轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程．
（2）常用的轉化方法：
將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是農桿菌轉化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等．
將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術．此方法的受體細胞多是受精卵．
將目的基因導入微生物細胞：
（3）重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達．
第四步：目的基因的檢測和表達
（1）首先要檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術．
（2）其次還要檢測目的基因是否轉錄出mRNA，方法是用標記的目的基因作探針與mRNA雜交．
（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原--抗體雜交． （4）有時還需進行個體生物學水平的鑒定．如轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀．
（5）基因文庫：是將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中通過克隆而儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，叫做基因文庫．建立基因文庫的目的就是為獲得大量的目的基因作準備．如果基因文庫中含有一種生物的所有基因，這個基因文庫就叫基因組文庫．

解答： 解：
（1）由于質粒在切割前是一個環狀DNA分子，因此上面沒有游離的磷酸基團；當質粒被切割后形成了兩個末端各有1個游離的磷酸基團，故共有2個游離的磷酸基團．
（2）SmaⅠ酶切位點越多，表示G和C這一對堿基對所占的比例就超高，而G和C之間含有三個氫鍵，故其熱穩定性超高．
（3）質�？股�素抗性基因為標記基因，由圖可知，標記基因和外源DNA目的基因中 均含有SmaI酶切位點，都可以被SmaI酶破環，故不能使用該酶剪切質粒和含有目的基因的DNA．
（4）構建含目的基因的重組質粒A時，選用 BamhHI 和HindⅢ酶對外源DNA和質粒進行切割，這樣使目的基因兩端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身環化，同理，也可以防止質粒自身環化．
（5）為了使目的基因和質粒之間的磷酸二脂鍵相連，需要用DNA連接酶相連接．
（6）抗生素抗性基因是一種抗性基因，抗性基因是為了鑒別和篩選目的基因是否導入到受體細胞內．
（7）由于分離獲取蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入大腸桿菌內，然后所給的培養基應為蔗糖為唯一含碳源的培養基．
故答案為：
（1）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ會破壞質粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因
（4）質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環化
（5）DNA連接
（6）鑒別和篩選含有目的基因的細胞
（7）蔗糖為唯一含碳營養物質

點評：本題以抗病香蕉味素材，考查基因工程和植物組織培養的相關知識，意在考查考生的理解能力、識記能力和應用能力．