Question

目前基因工程所用的質粒載體主要是以天然細菌質粒的各種元件為基礎重新組建的人工質粒，pBR322質粒是較早構建的質粒載體，其主要結構如圖一所示。

（1）建構基因表達載體時，必須有               、復制原點、目的基因、終止子以及                                    。

（2）構建人工質粒時要有抗性基因，以便于                    。

（3）pBR322分子中有單個EcoRI限制酶作用位點，EcoRl只能識別序列—GAATTC一，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側各有1個EcoRl的切點，請畫出目的基因兩側被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端                   。

（4）pBR322分子中另有單個的BamHI限制酶作用位點，現將經BamHI處理后的質粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復         ，成功獲得了重組質粒。說明                         。

（5）為了檢測上述重組質粒是否導入原本無amp^R和tet^R的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養基上培養，得到如圖二的菌落；再將滅菌絨布按到培養基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環素的培養基上培養，得到如圖三的結果（空圈表示與圖二對照無菌落的位置）。與圖三空圈相對應的圖二中的菌落表現型是            。圖三結果顯示，多數大腸桿菌導入的是                 。

Answer 1

（1）啟動子  植物體細胞雜交  標記基因（可互換位置）

（2）篩選（鑒別目的基因是否導入受體細胞）。

（3）

（4）磷酸二酯    兩種限制酶（BamHI和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同

（5）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環素        pBR322質粒

【解析】作為運載體的質粒，應該具有標記基因，以利于鑒別目的基因是否導入受體細胞，還應該具有啟動子和終止子，以利于目的基因的表達。限制酶的作用是切出黏性末端，連接酶的作用是催化3，5一磷酸二酯鍵的形成。既然經BamHI處理后的質粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用能恢復3，5一磷酸二酯鍵，則說明BarnHI和BglⅡ切割得到的黏性末端相同。實驗由圖二進行到圖三，相當于應用了“孢子印”。如果圖三的培養基與圖二中的一樣，則圖三中的結果理應與圖二一樣。出現圖三中的空圈，說明了圖三中的四環素對大腸桿菌產生了毒害作用，也就說明了該種大腸桿菌無抗四環素的能力。