Question

13．下圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度（bp即堿基對）和部分堿基序列，圖2表示一種質粒的結構和部分堿基序列．現有MspI、BamHI、MboI、SmaI 4種限制性核酸內切它們識別的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．

（1）若用限制酶SmaI完全切割圖中含有目的基因D的DNA片段，其產物長度分為537、790、661． 若圖左DNA分子中虛線方框內的堿基對被T-A堿基對替換，那么基因D就突變為基因d．從隱形純合子中分離出圖示對應的DNA片段，用限制酶Sma I完全切割，產物中共有2種不同長度的DNA片段．
（2）為了提高試驗成功率，需要通過PCR技術擴增目的基因，以獲得目的基因的大量拷貝．在目的基因進行擴增時，加入的引物有A、B兩種，若該目的基因擴增n代，則其中含有A、B引物的DNA分子有2ⁿ-2個．
（3）若將圖中質粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行連接，形成重組質粒，那么應選用的限制酶是BamH1．

（4）為了篩選出成功導入含目的基因D的重組質粒的大腸桿菌，首先將大腸桿菌在含抗生素B的培養基上培養，得到如圖示的菌落．再將滅菌絨布按到培養基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含抗生素A的培養基上培養，得到如圖4的結果（空圈表示與圖3對照無菌落的位置）．挑選目的菌的位置為圖1培養基中對應圖2中消失的菌落．
（5）若目的基因在工程菌中表達產物是一條多肽鏈，如考慮終止密碼，則其至少含有的氧原子數為340．

Answer 1

分析 分析圖1：圖中DNA片段含有2個限制酶MspⅠ和SmaⅠ切割位點，也含有兩個限制酶BamHⅠ和MboⅠ切割位點．基因D兩側序列為GGATCC，可被限制酶BamHⅠ切割．
分析圖2：質粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割．用限制酶BamHⅠ切割破壞了抗生素A抗性基因，但沒有破環抗生素B抗性基因，因此含有重組質粒的大腸桿菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A．

解答 解：（1）圖1中DNA片段含有兩個SmaⅠ酶切位點，被SmaⅠ酶完全切割后出現三個長度的片段，分別是537bp、790bp、661bp．發生基因突變后的d基因片段只有一個SmaⅠ酶切位點，完全切割后出現兩個片段長度分別是1327bp、661bp，所以隱形純合子中分離的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成會2種不同的DNA片段．
（2）為了提高試驗成功率，需要通過PCR技術擴增目的基因，以獲得目的基因的大量拷貝．由于PCR技術運用了DNA復制的原理，因此目的基因擴增n代后產生子代DNA分子2ⁿ．又由于親代DNA分子的兩條鏈中不含引物，因此含有A、B引物的DNA分子有2ⁿ-2 個．
（3）基因表達載體構建的過程中需要利用限制酶和DNA連接酶．限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位點位于目的基因D上，若用這兩種酶切割會被破壞目的基因D；運載體的兩個標記基因上都有限制酶MboⅠ的切割位點，用該酶切割會破壞這兩個標記基因，因此只能選用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和運載體．
（4）用限制酶BamHⅠ切割質粒后，用限制酶BamHⅠ切割破壞了抗生素A抗性基因，但沒有破環抗生素B抗性基因，因此首先用含有抗生素B的培養基培養大腸桿菌，能生存下來的是含有普通質粒和重組質粒的大腸桿菌；再用含有抗生素A的培養基培養，能生存下來的是含有普通質粒的大腸桿菌．最后能在培養皿1上生存，但不能在培養皿2上生存的大腸桿菌菌落進行培養，即可得到含重組質粒的大腸桿菌．圖4中空心圈在圖3中對應的位置是含目的基因的重組質粒的大腸桿菌的菌落．
（5）不同生物共用一套遺傳密碼子，所以基因D能再大腸桿菌內成功表達．基因D含有1020對堿基，最多能翻譯形成含有$\frac{1020}{3}$-1（終止密碼子）=339個氨基酸的多肽鏈．多肽鏈含有O原子數=肽鍵數+2肽鏈數+R基中的O原子數，所以該多肽至少含有O原子數為338+2×1=340個．
故答案為：
（1）537    790    661     2   
（2）2ⁿ-2     
（3）BamH1
（4）抗生素B    抗生素A     圖1培養基中對應圖2中消失的菌落     
（5）340

點評 本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理、操作工具及操作步驟，能結合圖中限制酶的識別序列判斷所選限制酶的種類，再根據抗性基因進行篩選，同時能結合圖中和題中的數據答題．