Question

16．血管內皮生長因子（ VEGF）能促進眼部視網膜血管的病理性生長．臨床上可用VEGF抗體的Fab片段（即抗體的活性片段）作為藥物治療視網膜病變．如圖所示是利用大腸桿菌來大量合成該抗體片段的技術路線圖，請回答下列問題：

（1）圖中的質粒在基因工程中常作為（運）載體，抗卡那霉素基因和抗四環素基因當作標記基因．其中的核心步驟是①（填圖中標號）
（2）科學家已經測出VEGF的抗體Fab片段的氨基酸序列，因此可以通過人工合成（化學合成）方法來獲取目的基因．獲取目的基因后，還需要在其兩端加上限制酶HindⅢ和XhoⅠ識別序列和啟動子T₇等序列，T₇的位置應該在2或3（填l、2、3或4）處．
（3）大腸桿菌常用Ca²⁺（或CaCl₂）處理，使之成為感受態細胞，以便吸收外源DNA；與重組質�；旌吓囵B一段時間后，用分別添加卡那霉素和四環素的培養基進行篩選；如果大腸桿菌在添加卡那霉素的培養基中能生長（或“能形成菌落”），在添加四環素的培養基中不能生長（或“不能形成菌落”），則為需要的目的菌株．
（4）對篩選出的大腸桿菌中目的基因是否成功表達，可以用抗原-抗體雜交技術進行檢測．即用血管內皮生長因子（VEGF）與提取出的蛋白質雜交來鑒定是否合成抗體Fab片段蛋白．

Answer 1

分析 分析題圖：圖示是利用大腸桿菌來大量和合成該抗體片段的技術路線圖，首先獲得目的基因（血管內皮生長因子（VE．GF），其次構建基因表達載體①，然后將基因表達載體導入受體細胞（大腸桿菌細胞）②，最后進行③篩選、培養和檢測，進行④擴大培養．

解答 解：（1）圖中的質粒在基因工程中常作為（運）載體，抗卡那霉素基因和抗四環素基因當作標記基因．基因工程的核心步驟為基因表達載體的構建，對應圖中的步驟①．
（2）科學家已經測出VEGF的抗體Fab片段的氨基酸序列，因此可以通過人工合成法來獲取目的基因，即根據Fab片段的氨基酸序列推測出信使RNA序列，再推測出結構基因的核苷酸序列，然后用化學的方法以單核苷酸為原料合成．獲取目的基因后，還需要在其兩端加上限制酶HindIII和XhoI識別序列和啟動子T7等序列，啟動子應位于目的基因上游，且不能被限制酶切割去除，因此T7的位置應該在圖中的2或3處．
（3）大腸杼菌經Ca²⁺處理，成為易于吸收周圍環境中DNA分子的感受態細胞，以便吸收外源DNA；由圖可知，構建基因表達載體時，四環素抗性基因被破壞，而卡那霉素抗性基因沒有被破壞，因此在培養基需添加卡那霉素以篩選目的菌株，即大腸桿菌在添加卡那霉素的培養基中能生長（或“能形成菌落”），在添加四環素的培養基中不能生長（或“不能形成菌落”）．
（4）將篩選出的大腸桿菌進行擴大培養，可以用血管內皮生長因子（VEGF）作為抗原與提取出的蛋白雜交來鑒定是否合成抗體Fab片段蛋白．
故答案為：
（1）（運）載體      標記基因       ①
（2）人工合成（化學合成）    2或3 （答“2”或“3”均給分）
（3）Ca²⁺（或CaCl₂）    感受態    能生長（或“能形成菌落”）    不能生長（或“不能形成菌落”）
（4）抗原-抗體雜交      血管內皮生長因子（VEGF）

點評 本題結合利用大腸桿菌來大量和合成該抗體片段的技術路線圖，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟中的細節，能結合圖中信息準確答題，屬于考綱識記和理解層次的考查．