Question

19．小立碗蘚是一種苔蘚植物，易培養(yǎng)，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，又因其同源重組的效率很高，已成為研究基因功能的良好材料．請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
（1）甲同學(xué)在使用高倍鏡觀察小立碗蘚的葉綠體時(shí)，發(fā)現(xiàn)在適宜條件下細(xì)胞中的葉綠體長(zhǎng)時(shí)間靜止不動(dòng)，最可能的原因是細(xì)胞已死亡．
（2）乙同學(xué)用小立碗蘚進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)操作：
步驟一：在潔凈的載玻片中央加一滴清水，放置一片小立碗蘚的小葉，蓋上蓋玻片．
步驟二：從蓋玻片一側(cè)滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，在蓋玻片的另一側(cè)用吸水紙吸引，這樣重復(fù)幾次．
步驟三：在顯微鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)葉綠體向細(xì)胞中間聚攏，說(shuō)明細(xì)胞已發(fā)生質(zhì)壁分離．
（3）同源重組在細(xì)胞中可自然發(fā)生，交叉互換的位點(diǎn)必須發(fā)生在特定的同源序列中，原理如圖1所示．已知由硫酸鹽降解酶（K基因編碼）催化某種硫酸鹽（APS）的降解是高等植物中硫酸鹽利用的關(guān)鍵步驟．有人提出，植物體中還存在著該硫酸鹽降解的支路（PAPS），但不能確定其相關(guān)酶是否在植物體中存在．科研人員利用小立碗蘚進(jìn)行了以下研究：
①測(cè)定K基因兩側(cè)的堿基序列．若測(cè)得在序列“5′…CGACCCGGGAGT…3′”中含有一個(gè)6個(gè)堿基對(duì)的限制酶SmaⅠ的識(shí)別序列，可推知該酶的識(shí)別序列為CCCGGG．
②質(zhì)粒pcDNA3上有Neo基因（新霉素抗性基因）和限制酶SmaⅠ、TthⅢ和BsmⅠ的酶切位點(diǎn)，如圖2所示．為了使Neo基因能與K基因發(fā)生同源重組，應(yīng)選用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ將Neo基因從質(zhì)粒上切下來(lái)，然后在該基因的兩側(cè)增加與K基因兩側(cè)相同的同源序列，構(gòu)建具有Neo基因的表達(dá)載體．
③制備小立碗蘚的原生質(zhì)體，將其放在等滲溶液中，利用聚乙二醇介導(dǎo)直接將Neo基因表達(dá)載體導(dǎo)入小立碗蘚細(xì)胞內(nèi)．
④在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述小立碗蘚細(xì)胞，若能夠發(fā)育成完整的植物體，則表明該植株已沒(méi)有K基因．若通過(guò)此轉(zhuǎn)化途徑得到的植株可利用硫酸鹽作為唯一硫源，說(shuō)明在小立碗蘚中存在PAPS支路．

Answer 1

分析 分析題意可知，觀察質(zhì)壁分離時(shí)，需用活細(xì)胞，用引流法替換為蔗糖溶液后，可觀察到質(zhì)壁分離現(xiàn)象；為了使Neo基因能與K基因發(fā)生同源重組，選用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ將該基因切下來(lái)，然后在該基因的兩側(cè)增加與基因M兩側(cè)相同同源序列的堿基，構(gòu)建具有抗性基因載體．質(zhì)粒pcDNA3上有Neo基因（新霉素抗性基因），故應(yīng)在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物細(xì)胞，進(jìn)行篩選．該實(shí)驗(yàn)的目的是研究植物體中還存在著該硫酸鹽降解的支路，故應(yīng)在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述小立碗蘚細(xì)胞，若能夠發(fā)育成完整的植物體，則表明該植株已沒(méi)有K基因．若通過(guò)此轉(zhuǎn)化途徑得到的植株可利用硫酸鹽作為唯一硫源，說(shuō)明在小立碗蘚中存在PAPS支路．

解答 解：（1）活細(xì)胞中葉綠體會(huì)隨細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)而運(yùn)動(dòng)，若發(fā)現(xiàn)在適宜條件下細(xì)胞中的葉綠體長(zhǎng)時(shí)間靜止不動(dòng)，最可能的原因是 細(xì)胞已死亡．
（2）乙同學(xué)用小立碗蘚進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)操作：
步驟一：制片觀察，在潔凈的載玻片中央加一滴清水，放置一片小立碗蘚的小葉，蓋上蓋玻片．
步驟二：用引流法替換為蔗糖溶液，即從蓋玻片一側(cè)滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，在蓋玻片的另一側(cè)用吸水紙吸引，這樣重復(fù)幾次．
步驟三：在顯微鏡下觀察，細(xì)胞失水后會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)層會(huì)向中央聚攏，故若發(fā)現(xiàn)葉綠體向細(xì)胞中間聚攏，說(shuō)明細(xì)胞已發(fā)生質(zhì)壁分離．
（3）①由于限制酶SmaⅠ的識(shí)別序列為回文序列，故可推知在序列“5′…CGACCCGGGAGT…3′”中該酶的識(shí)別序列為 CCCGGG．
②為了使Neo基因能與K基因發(fā)生同源重組，選用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ將該基因從質(zhì)粒上切下來(lái)，然后在該基因的兩側(cè)增加與基因M兩側(cè)相同同源序列的堿基，構(gòu)建具有抗性基因載體．
③去除植物細(xì)胞壁采用酶解法，用纖維素酶和果膠酶處理細(xì)胞，得到原生質(zhì)體．為防止原生質(zhì)體吸水漲破，應(yīng)在等滲或微高滲溶液中用PEG做促溶劑，將Neo基因載體導(dǎo)入小立碗蘚細(xì)胞內(nèi)．
④該實(shí)驗(yàn)的目的是研究植物體中還存在著該硫酸鹽降解的支路，故應(yīng)在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述小立碗蘚細(xì)胞，若能夠發(fā)育成完整的植物體，則表明該植株已沒(méi)有K基因．若通過(guò)此轉(zhuǎn)化途徑得到的植株可利用硫酸鹽作為唯一硫源，說(shuō)明在小立碗蘚中存在PAPS支路．
故答案為：
（1）細(xì)胞已死亡　
（2）用吸水紙吸引　細(xì)胞已發(fā)生質(zhì)壁分離
（3）①CCCGGG　
②SmaⅠ和BsmⅠ同源序列　
③等滲
④新霉素　可利用硫酸鹽作為唯一硫源

點(diǎn)評(píng) 本題主要考查細(xì)胞觀察、基因工程、構(gòu)建基因表達(dá)載體的相關(guān)知識(shí)，意在考查考生的識(shí)圖能力和理解所學(xué)知識(shí)要點(diǎn)，把握知識(shí)間內(nèi)在聯(lián)系的能力；能運(yùn)用所學(xué)知識(shí)，對(duì)生物學(xué)問(wèn)題作出準(zhǔn)確的判斷，難度適中．