Question

10．EPSPS是葉綠體中的一種酶，它能催化芳香族氨基酸的合成；草甘膦是一種除草劑，它能競爭性抑制EPSPS的作用而使植物死亡．因此草甘膦的使用也會影響到農作物的正常生長．目前，已發現可以從一種抗草甘膦的大腸桿菌突變株中分離出EPSPS基因，若將該基因轉入農作物植物細胞內，從而獲得的轉基因植物就能耐受高濃度的草甘膦．
（1）普通大豆施用草甘膦之后，電鏡下可以看到葉綠體很快變形，其原因是氨基酸合成受阻直接影響了蛋白質的合成，使葉綠體內的其結構和功能嚴重受損從而使植物死亡．
（2）研究人員以大豆“黑農37”胚尖為外植體，利用農桿菌介導法將EPSPS基因成功轉入大豆，大豆產生了更多的EPSPS來抵抗草甘膦，成為抗除草劑（草甘膦）大豆．
①下表分別表示4種限制性核酸內切酶的酶切位點．假設位于EPSPS基因兩側的DNA序列
分別為$\left.\begin{array}{l}{-CAGGATCCC}&{-}\\{-GTCCTAGGG}&{-}\end{array}\right.$和$\left.\begin{array}{l}{-AAGCTTGAC}&{-}\\{-TTCGAACTG}&{-}\end{array}\right.$，則應選擇表中酶2和3進行酶切．若EPSPS基因的右側序列如后者所示，請在如圖1方框內畫出經酶切后產生的兩個末端的堿基序列．

酶的種類	1	2	3	4
酶切位點

②若多個如圖2所示的片段甲和片段乙混合在一起，用DNA連接酶拼接得到環狀DNA，其中只由兩個DNA片段連接成的環狀DNA分子有3種．
（3）要測定EPSPS基因最終是否整合到大豆的某一染色體上，可用DNA分子雜交方法，或直接測定該染色體的DNA序列
（4）圖3是目的基因EPSPS（4.0kb，1kb=1000對堿基）與pUC18質粒（2.7kb）重組的示意圖．圖中Ap′是抗氨芐青霉素基因，lacZ是顯色基因，其上的EcoRⅠ識別位點位于目的基因插入位點的右側．現用EcoRⅠ酶切質粒，酶切后進行電泳觀察，若出現長度為3和3.7kb和1.0和5.7kb的片段，則可以判斷該質粒已與目的基因重組成功．（重組質粒上目的基因的插入位點與EcoRI的識別位點之間的堿基對忽略不計）．

Answer 1

分析 切割DNA的工具是限制性核酸內切酶，又稱限制酶，限制酶是基因工程必需的工具酶，其特性是一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列．
分析圖3可知：植物A和D對草甘膦敏感，B和E對草甘膦天然具有抗性，C和F則經過了轉基因處理，所以A-C澆清水，都能健康成長．F雖經過了轉基因處理，但是否成功還未知，所以D-F澆的水中含有草甘膦，D肯定不能健康成長，E肯定能健康成長，F未知．
一種限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂．

解答 解：（1）草甘膦能競爭性抑制EPSPS的作用，而EPSPS是葉綠體中的一種酶，它能催化芳香族氨基酸的合成，所以普通大豆施用草甘膦之后死亡的原因是：葉綠體的類囊體薄膜上的蛋白質的合成受阻，使得葉綠體的結構受損，從而導致功能受損．
（2）①因為限制酶具有特異性識別的能力，對照圖1和2所示，則應選擇表中酶2和3同時進行酶切．畫圖時要注意：畫出完整的DNA片段，要有兩個黏性末端，化學鍵、堿基序列完整且正確，．
②多個片段甲和多個片段乙混合，用DNA連接酶連接可形成甲甲、乙乙、甲乙三種連接方式（只考慮兩個DNA片段連接），所以其中只由兩個DNA片段連接成的環狀DNA分子有3種．
（3）檢測目的基因是否整合到受體細胞的染色體上，常用的方法是DNA分子雜交，也可以直接來測定受體細胞染色體上的DNA序列．
（4）目的基因被酶切后形成兩個片段：1.0kb和3.0kb；質粒被酶切后長度不變：2.7kb．故質粒只能和目的基因片段之一發生重組，如果成功的話將會出現兩種情況：3kb和3.7kb或1.0kb和5.7kb．
故答案：
（1）蛋白質
（2）①2和3
 
②3 
（3）DNA分子雜交   DNA序列
（4）3和3.7或1.0和5.7

點評 本題重點考查基因工程的有關知識，要求掌握基因工程的操作步驟及在生產實踐中的運用；能夠對基因工程中DNA片段的長短進行簡單的計算，難度適中．