Question

6．請回答基因工程方面的有關問題：
（1）利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（如圖所示）．圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎．

①理論上推測，第四輪循環產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為$\frac{15}{16}$．
②在第三輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段．
（2）設計引物是PCR技術關鍵步驟之一．某同學設計的兩組引物（只標注了部分堿基序列）都不合理（如圖），請分別說明理由．
①第1組：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效；
②第2組：引物Ⅰ'自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效．
（3）PCR反應體系中含有熱穩定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上．

（4）用限制酶EcoRV、MboⅠ單獨或聯合切割同一種質粒，得到的DNA片段長度如下圖（1kb即1000個堿基對），請畫出質粒上EcoRV、MboⅠ的切割位點．

Answer 1

分析 采用PCR技術擴增DNA的過程為：變性、退火、延伸．根據PCR過程的特點繪制PCR過程示意圖如圖所示：

據圖答題．

解答 解：（1）①由圖可知，由原來的每條母鏈為模板合成的兩個新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時，兩種引物都含有，故第四輪循環共產生16個DNA分子，其中含有引物A的分子是15個，占$\frac{15}{16}$．
②由圖示可知，第一、二輪循環合成的子鏈長度均不同，根據半保留復制特點可知，前兩輪循環產生的四個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環產生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，如上圖．
（2）在第1組引物中，引物Ⅰ的部分堿基序列是CAGGCT，引物Ⅱ的部分堿基序列是AGCCTG，若利用這兩個引物進行DNA擴增，會因其中的部分堿基發生堿基互補配對而使引物失效．在第2組引物中，引物Ⅰ′的部分堿基序列是AACTG和CAGTT，該引物一旦發生自身折疊，也將會出現部分堿基發生堿基互補配對而使引物失效．
（3）圖中直接將兩個脫氧核苷酸合成DNA單鏈，這不能反映DNA聚合酶的功能，因為DNA聚合酶只能在DNA模板存在的條件下，將單個脫氧核苷酸連續結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上．
（4）根據圖示，該質粒為環形質粒．用限制酶EcoRⅤ單獨切割該質粒時，只形成一個片段，說明該質粒上只有1個限制酶EcoRⅤ的識別位點．用限制酶MboⅠ單獨切割該質粒時，形成兩個片段，說明該質粒上有兩個限制酶MboⅠ的識別位點．用限制酶EcoRⅤ和MboⅠ聯合切割該質粒時，形成三個片段，其中有一個片段的長度與用MboⅠ單獨切割該質粒時產生的片段長度相同（2.5kb），另外的兩個片段是5.5kb和6kb，這說明限制酶EcoRⅤ的切割位點存在于用MboⅠ單獨切割該質粒時產生的另一片段（11.5kb）上．質粒上EcoRV、MboI的切割位點如圖所示．
故答案為：
（1）①$\frac{15}{16}$     ②三
（2）①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效
②引物Ⅰ'自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效
（3）DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上
（4）見圖

點評 本題結合PCR過程示意圖，考查PCR技術、DNA分子復制、基因工程等知識，要求考生識記PCR技術的過程及原理，能分析題圖提取有效信息答題；掌握DNA分子半保留復制特點，能進行簡單的計算；能根據題干信息判斷限制酶在質粒上的位置．