Question

13．bar基因（抗除草劑基因）對除草劑PPT有抗性，來自吸水鏈霉菌．下列資料是抗PPT轉基因棉的培育過程．
資料1：根據bar基因兩端已知的堿基序列，設計合成了如下引物：
上游引物：5′-CGGAATT…C-3′
下游引物：5′-TACAAGCTT…G-3′
PCR擴增程序為：預變性后，94℃、30S；65℃、30S；72℃、1min，共35個循環．
資料2：用EcoRI/HindⅢ雙酶切PCR產物和質粒pET30后，用T₄-DNA連接酶連接，構建bar基因表達載體（pET30-bar），EcoRI識別切割G↑AATTC，HindⅢ識別切割A↑AGCTT．
資料3：將pET30-bar導入處于感受態的根癌農桿菌中，用含有卡那霉素的YEB固體培養基篩選出轉化的根癌農桿菌，將其菌液加入棉花愈傷組織培養基中，20天后，再移入分化培養基誘導生芽、生根，形成試管苗后移栽．
情分析回答：
Ⅰ、根據資料1分析：
（1）目的基因的獲取方法為PCR擴增，在PCR擴增時，除DNA模板外，還需要Taq酶和原料，Taq酶的特點是耐高溫．
Ⅱ、根據資料2回答：
（2）用EcoRⅠ/HindⅢ對質粒和PCR產物進行雙酶切得原因有ABCD（多選）．
A．防止質粒自身環化         B．防止bar基因自身環化
C．利于bar基因的單向連接    D．抑制切割后的分子串連形成寡素物
Ⅲ、根據材料3分析：
（3）用Ca²⁺（CaCI₂）處理，可使根癌農桿菌進入感受態，為篩選出含bar基因的棉花愈傷組織，在愈傷組織培養基中除加入卡那霉素外，還應加入適宜濃度的除草劑PPT．在分化培養時，通過調節生長素和細胞分裂素的比例，完成對根、芽的分化誘導．

Answer 1

分析 1、獲取目的基因的方法主要有兩種：一種是從供體細胞的DNA中直接分離基因，最常用的方法是“鳥槍法”又叫“散彈射擊法“；另一種是人工合成基因．
基因文庫是指將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因．
基因組文庫包含某種生物所有的基因；部分基因文庫包含某種生物的部分基因．如：cDNA文庫．
2、將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法．
3、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）獲取目的基因的方法主要有兩種：一種是從供體細胞的DNA中直接分離基因，最常用的方法是“鳥槍法”又叫“散彈射擊法“；另一種是人工合成基因．在PCR擴增時，除DNA模板外，還需要Taq酶和原料，Taq酶為耐高溫的DNA聚合酶，其特點是耐高溫．
（2）只使用EcoRI，則質粒和目的基因兩端的粘性末端相同，用DNA連接酶連接時，會導致質粒和目的基因自身環化；而利用EcoRⅠ/HindⅢ剪切時，質粒和目的基因兩端的粘性末端不同，用DNA連接酶連接時，不會產生自身環化．有利于bar基因的單向連接，并抑制切割后的分子串連形成寡聚物．
（3）將目的基因導入微生物細胞時，常采用感受態細胞法，即用Ca²⁺處理微生物細胞，使其成為感受態細胞，更容易吸收周圍環境中的DNA分子．為篩選出含bar基因的棉花愈傷組織，需用選擇培養基，即在愈傷組織培養基中除加入卡那霉素外，還應加入適宜濃度的除草劑PPT．不同的生長素和細胞分裂素的比例可影響根或芽的分化，故在分化培養時，通過調節生長素和細胞分裂素的比例，完成對根、芽的分化誘導．
故答案為：
（1）PCR擴增    耐高溫
（2）ABCD
（3）Ca²⁺（CaCI₂）       除草劑PPT    生長素和細胞分裂素

點評 本題考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因文庫的種類，掌握兩種基因文庫的區別；識記PCR技術的條件；識記基因工程的具體操作步驟及相關細節，能結合所學的知識準確答題．