Question

【題目】ACC合成酶是乙烯合成過程中的關鍵酶，由ACC合成酶基因（簡稱A基因）控制合成。將A基因反向連接在啟動子和終止子間可構成反義ACC合成酶基因（A1基因），轉A1基因番茄的后熟過程變慢，利于番茄的儲藏和運輸。

請回答：

（1）從番茄的果肉細胞中提取RNA，利用RT－PCR獲取A基因，即利用RNA和PCR技術獲取目的基因。利用RT－PCR獲取A基因所需要的酶主要有___________。在A基因擴增過程中需要特定的引物，該引物的作用是_____________________________。

（2）S1和S2為A基因和A1基因的特異性啟動子，S2在番茄果肉細胞內起作用，S1在除果肉細胞外的其他細胞內起作用。在構建轉A1基因表達載體時，啟動子應選擇____________，不選另一個的理由是___________________。A1基因的表達元件包括啟動子、終止子以及反向連接在兩者之間的A基因，若用農桿菌轉化法將此元件整合到番茄細胞的染色體DNA上，則應將此元件應構建在Ti質粒的____________中。

（3）在檢測番茄細胞的染色體DNA上是否插入了A1基因時，__________（填“能”“不能”）用放射性物質標記的A基因做探針進行檢測，理由是________________________。檢測表明，與非轉基因番茄相比，轉A1基因蕃茄的果肉細胞內乙烯含量下降，機理是______________________________。

Answer 1

【答案】逆轉錄酶和Taq酶 定位A基因的位置，與模板鏈結合并為子鏈的延伸提供起點 S2 S1不在果肉細胞內起作用，番茄果實不會后熟；S1在番茄植株細胞內起作用后會導致番茄植株的乙烯合減少，影響番茄植株的正常生理活動 T-DNA 不能 蕃茄細胞內本身有A基因，無論是否插了A1基因都能與探針雜交形成雜交帶 轉基因番茄細胞中存有A基因與A1基因，二者轉錄產生的mRA能雜交形成雙鏈，導致ACC合成酶的合成受阻，從而使乙烯的合成量降低

【解析】

基因工程的操作步驟：1.提取目的基因、2.構建基因表達載體、3.將目的基因導入受體細胞、4.目的基因的檢測和鑒定。PCR技術可擴增目的基因，該技術需要耐高溫的DNA聚合酶和引物，其中引物的作用是定位要擴增DNA的區段，與模板鏈結合并為子鏈的延伸提供起點。

（1）由RNA經RT-PCR技術獲取了cDNA，進而獲得A因，故RT-PCR技術包含了逆轉錄和PCR兩個過程，因此需要逆轉錄酶和Taq酶。引物和模板結合后，定位了要擴增DNA的區段，即定位A基因。由于Taq酶只能從單鏈的3′端延伸，因此引物提供了子鏈的延伸起點。

（2）S1在番茄的植株細胞內起作用，不在果肉細胞內起作用，番茄果實不會后熟，因此啟動子應選擇S2。同時也考慮到S1在番茄植株內起作用后會導致番茄植株的乙烯合減少，影響番茄植株的正常生理活動。T-DNA是Ti質粒的可轉移區段，表達元件應構建在Ti質粒的T-DNA上。

（3）茄細胞內本身有A基因，無論是否插入了A1基因，A基因A1基因都能與探針雜交形成雜交帶，因此不能用放射性物質標記的A1基因做探針進行檢測。

（4）在轉A1基因的番茄果肉內，同時存有A基因和A1基因，二者轉錄產生的兩種mRNA的堿基互補，會通過核酸分子雜交雜交形成雙鏈，從而導致ACC合成酶的合成受阻，最終使乙烯的合成量與含量下降，使番茄的后熟過程變慢。