Question

【題目】水蛭素是一種小分子蛋白質，其對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發現的最強凝血酶天然特異抑制劑。通過基因工程技術生產水蛭素的方法如下圖所示。請據圖回答：

（1）過程①需要的原料是__________，過程③必需的酶有__________，過程④為提高導入效率，常用__________溶液處理大腸桿菌。

（2）過程②中可通過__________技術大量擴增水蛭素基因，被擴增的水蛭素基因必須有一段核苷酸序列是已知的，以便根據這一序列合成__________。

（3）水蛭素基因不含質粒圖譜中限制酶識別序列。為使水蛭素基因重組進該質粒，水蛭素基因兩端需分別加入不同限制酶__________和__________的識別序列。

（4）在導入重組質粒后，過程⑤為了篩選出含重組質粒的大腸桿菌，一般需要用添加__________的培養基進行培養。

Answer 1

【答案】脫氧核苷酸(dNTP或dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 限制酶和DNA連接酶 CaCl2 PCR 引物 AscⅠ BamHⅠ 卡那霉素

【解析】

基因工程操作的四個步驟為：1、獲取目的基因2、構建基因表達載體3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測和表達。獲得目的基因的方法：①從基因文庫中獲取②利用PCR技術擴增③人工合成(化學合成)。限制酶的作用是識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂．

（1）①是通過反轉錄法形成cDNA的過程，此過程需要的原料是脫氧核苷酸(dNTP或dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。③是構建重組表達載體的過程，需要用限制酶切割質粒與目的基因，同時需要用DNA連接酶把目的基因與質粒連在一起，過程④為提高導入效率，常用CaCl2溶液處理大腸桿菌。

（2）過程②中可通過PCR技術大量擴增水蛭素基因，被擴增的水蛭素基因必須有一段核苷酸序列是已知的，以便根據這一序列合成引物。

（3）為使水蛭素基因重組進該質粒，需要用與質粒圖譜中相同的識別序列的限制酶切割水蛭素基因，而圖中的限制酶pvuI可破壞卡那霉素抗性基因，限制酶BssSI破環復制原點，限制酶XbaI破壞啟動子，限制酶SalI破環終止子，因此為使水蛭素基因重組進該質粒，水蛭素基因兩端需分別加入不同限制酶AscⅠ和BamHⅠ的識別序列。

（4）在導入重組質粒后，過程⑤為了篩選出含重組質粒的大腸桿菌，一般需要用添加卡那霉素的培養基進行培養。