Question

【題目】研究人員利用小鼠的單倍體ES細胞（只有一個染色體組），成功培育出轉基因小鼠。其主要技術流程如圖所示，請分析回答下列問題：

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表四種限制酶。箭頭指向的位置為限制酶的切割位置：Amp是氨芐青霉素抗性基因，Neo是G418抗性基因。

（1）利用PCR技術可以擴增目的基因，PCR反應體系中除含授沖液、模板DNA、dNTP(包含dNTP、dATO、dcTP、dGTP、dTTP）、引物以外，還應含有_______；引物應選用下圖中的 _____（填圖中標號）。

（2）已知氨芐青霉素不能有效殺死小鼠細胞，而一定濃度的G418能有效殺死不具有Neo的小鼠細胞。結合上圖推測，過程①選用的2種限制酶是______（選填圖中的編號），③處的培養液應添加_____（填“氨芐青霉素”或“G418”）

（3）細胞乙與____類似，圖中桑椹胚需要通過_____技術移入代孕小鼠子宮內繼續發育，進行該操作前需對小鼠進行_____處理。

Answer 1

【答案】Taq酶(或耐高溫的DNA聚合酶） A和D I 和 II G418 受精卵 胚胎移植 同期發情

【解析】

PCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術，該技術可以在短時間內大量擴增目的基因。步驟：變性→復性→延伸。PCR反應的條件：模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物、耐高溫的DNA聚合酶，其中，dNTP的作用是合成DNA的原料、提供能量。

圖中用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割質粒會破壞氨芐青霉素抗性基因，保留G418抗性基因；用限制酶Ⅲ、Ⅳ切割質粒會破壞G418抗性基因，保留氨芐青霉素抗性基因。不能用Ⅰ、Ⅳ或Ⅱ、Ⅲ同時切割，會同時破壞兩個抗性基因。

圖中2構建基因表達載體，之后把目的基因導入小鼠單倍體ES細胞中，去其核與次級卵母細胞的進行融合，類似于受精作用。

（1）根據分析可知，PCR反應體系中除含緩沖液、模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物以外，還應含有耐高溫的DNA聚合酶。為了擴增目的基因的片段，根據圖示可知需要在引物A和D作用下以目的基因的兩條鏈為模板合成子代目的基因。

（2）由圖可知，過程①②是將目的基因和運載體連接形成重組質粒，即基因表達載體的構建過程。重組質粒上的抗生素抗性基因可作為標記基因，其作用是有利于篩選出含有目的基因的細胞。根據題意可知，氨芐青霉素不能有效殺死小鼠細胞，而一定濃度的G418能有效殺死不具有Neo′的小鼠細胞，因此應選擇Neo′作為標記基因，即質粒上Neo′不能用限制酶切割，則過程①應選用Ⅰ和Ⅱ兩種限制酶，圖中③處的培養液應添加G418以便于起到篩選的作用。

（3）處理形成的細胞乙與受精卵類似，應用早期胚胎培養技術可以使其發育成桑椹胚。再將桑椹胚通過胚胎移植技術移入代孕小鼠子宮內繼續發育，進行該操作前需對受體小鼠進行同期發情處理，以保證供體與受體處于相同或相近的生理狀態。