Question

【題目】GDNF是一種神經營養因子，對損傷的神經細胞具有營養和保護作用。研究人員構建了含GDNF基因的表達載體（如圖1所示），并導入到大鼠神經干細胞中，用于干細胞基因治療的研究。

（1）一個GDNF基因含有___個游離的磷酸基團，理論上而言，與GDNF基因含有相同堿基數的DNA分子共有_____種不同的排序。

（2）限制酶的特點是___________________________，構建含GDNF基因的表達載體時，需選擇圖1中的______限制酶進行酶切。

（3）下列有關基因工程的運載體中標記基因的說法正確的是_______。

A．可檢測重組DNA分子是否導入了受體細胞

B．可指示受體細胞是否導入運載體

C．可指示運載體中是否插入了外源DNA片段

D．可檢測目的基因在受體細胞中是否成功表達

（4）通常使用限制酶后會產生粘性末端，對下圖所示粘性末端的說法正確的是______。

A．甲、乙、丙粘性末端是由各自不同的限制性核酸內切酶催化產生的

B．甲、乙具相同的粘性末端可形成重組DNA分子，但甲、丙之間不能

C．DNA連接酶作用位點在b處，催化磷酸基團和脫氧核糖之間形成化學鍵

D．切割甲的限制性核酸內切酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子

（5）經酶切后的載體和GDNF基因進行連接，連接產物經篩選得到的載體主要有三種：單個載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示）。為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對篩選的載體進行雙酶切，并對酶切后的DNA片段進行電泳分析，結果如圖2所示。圖中第_____泳道顯示所鑒定的載體是正向連接的。

Answer 1

【答案】2個 4700 特異性的識別并切割DNA XhoⅠ ABC ABD 2

【解析】

1、基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法；

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術，個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）該基因是鏈狀DNA分子，所以含有游離的磷酸基團2個，GDNF基因有700個堿基，所以可能的DNA分子由4700種。

（2）限制酶是能夠特異性的識別DNA片段，并在特定的位點將DNA片段切割；由于質粒上有XhoⅠ識別位點，而且在啟動子之后，所以選用XhoⅠ限制酶進行酶切。

（3）ABC、運載體中的標記基因可檢測重組DNA分子是否導入了受體細胞或可指示哪些細胞是轉化細胞或可指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，ABC正確。

D、檢測目的基因是否轉錄采用分子雜交技術，檢測目的基因是否翻譯采用抗原-抗體雜交法，D錯誤。

故選ABC。

（4）A、切割甲的限制酶的識別序列是-GAATTC-，切割乙的限制酶的識別序列是-CAATTG-，切割丙的限制酶的識別序列是-CTTAAG-，序列不同，所以是由不同的限制性核酸內切酶催化產生的，A正確；

B、甲和乙的黏性末端相同，可以被DNA連接酶連接形成重組DNA分子，而甲和丙的黏性末端不同，因此不能連接形成重組DNA分子，B正確；

C、DNA連接酶連接的是DNA片段，所以該酶能催化磷酸基團和脫氧核糖之間形成磷酸二酯鍵，作用位點在a處，C錯誤；

D、甲、乙片段形成的重組DNA分子的序列是-CAATTC-，而甲酶的識別序列是-GAATTC-，且在G和A之間切割，由此可見，甲酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。

故選ABD。

（5）經酶切后的載體和GDNF基因進行連接，連接產物經篩選得到的載體主要有三種：單個載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示），為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對篩選的載體進行雙酶切，若屬于載體自連，且產生的酶切片段只有一種；若是正向連接的重組載體，其產生的酶切片段數為2個，且長度分別與質粒和GDNF基因長度相同；若是正向連接的重組載體，酶切后產生兩種長度的片段，即700bp和600bp，第二條帶。