Question

【題目】MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ三種限制酶的識別序列及切割位點分別是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，如圖1、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切點。圖3表示利用基因工程生產胰島素的三種途徑。圖4表示改造哺乳動物遺傳特性的三種途徑。請據圖回答問題。

（1）若要用如圖1和圖2中的質粒和外源DNA構建重組質粒，需要對質粒進行改造，構建新的限制酶切位點。在構建新的限制酶切位點的過程中需要使用哪些工具酶___________________。

（2）圖3中催化過程①的DNA連接酶的作用是促使形成_________________，導入受體細胞B常用方法_______________，④過程也可以培養到______________，再從培養液中提取細胞代謝產物。

（3）圖3中導入受體細胞C首先使用Ca2+處理使其吸收周圍的DNA分子，之后將細胞C與圖中M溶于緩沖液中，完成轉化過程，其中用Ca2+處理的目的是________________。

Answer 1

【答案】限制酶EcoRⅠ、DNA聚合酶、DNA連接酶 磷酸二酯鍵 農桿菌轉化法 愈傷組織 增加細菌細胞壁的通透性

【解析】

分析題圖：圖1質粒中含有限制酶PstⅠ和EcoRⅠ的切割位點。圖2含目的基因的外源DNA中含有限制酶PstⅠ、MseⅠ、EcoRⅠ的切割位點，其中EcoRⅠ酶的切割位點位于目的基因中。圖3中①表示基因表達載體的構建，②表示將目的基因導入受體細胞，③表示早期胚胎培養技術，④表示植物組織培養，⑤表示微生物實驗室培養。

（1）含目的基因的外源DNA中含有限制酶PstⅠ、MseⅠ、EcoRⅠ的切割位點，其中EcoRⅠ酶的切割位點位于目的基因中，因此構建基因表達載體時，不能用EcoRⅠ酶切割，應該用限制酶PstⅠ、MseⅠ進行切割，則對質粒進行改造時，應該將限制酶EcoRⅠ的切割位點改造成限制酶MseⅠ的切割位點。因此，首先需要用限制酶EcoRⅠ切割，其次需要用DNA聚合酶將相應的脫氧核苷酸序列連接上去，最后再用DNA連接酶連接形成限制酶MseⅠ的切割位點。所以在構建新的限制酶切位點的過程中需要使用限制酶EcoRⅠ、DNA聚合酶、DNA連接酶等工具酶。
（2）DNA連接酶的作用是促使形成磷酸二酯鍵，導入受體細胞B（萵苣）常用方法為農桿菌轉化法，④過程表示植物組織培養，可以培養到愈傷組織，再從培養液中提取代謝產物，原因是細胞代謝強、增殖快。
（3）導入受體細胞C（大腸桿菌）首先使用Ca2+處理，目的是增加細菌細胞壁的通透性，使其容易吸收周圍的DNA分子，之后將細胞C與圖中M（基因表達載體）溶于緩沖液中，完成轉化過程。