Question

【題目】稻瘟病是水稻最重要的病害之一，為達到防治目的，科研人員通過轉基因技術培育出了抗稻瘟病水稻品種。回答下列問題：

（1）通過 RT-PCR 技術以抗稻瘟病基因的 RNA 為模板擴增出 cDNA。在 PCR 過程中，兩個引物是_____酶的結合位點；用 cDNA 單鏈與該抗性水稻植株的單鏈 DNA 進行分子雜交，可能出現游離的單鏈區，其原因是_____。

（2）利用 RT-PCR 技術擴增基因時，設計兩種引物的堿基序列的主要依據是_____，為了便于擴增后的X 基因與質粒連接，常在兩條引物上設計加入不同的限制酶酶切位點，主要目的是_____。

（3）基因工程中，將重組質粒導入植物細胞采用最多的方法是_____，導入動物受精卵采用的方法是_____。

（4）若要檢測抗稻瘟病基因是否翻譯出相應蛋白質，可采用的分子水平的檢測方法是_____。

Answer 1

【答案】熱穩定DNA聚合 DNA分子含有內含子非編碼區等序列，mRNA分子中沒有相應互補的堿基序列 X基因兩端的部分脫氧核苷酸序列 使X基因能定向插入表達載體，減少自連 農桿菌轉化法 顯微注射法 抗原-抗體雜交

【解析】

1、有關PCR技術的相關知識：

（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。

（2）原理：DNA復制。

（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。

（4）過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

2、基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）在PCR過程中，兩個引物是熱穩定DNA聚合酶的結合位點；用cDNA單鏈與該抗性水稻植株的單鏈DNA進行分子雜交，由于DNA分子含有內含子、非編碼區等序列，mRNA分子中沒有相應互補的堿基序列，因此逆轉錄形成的cDNA中缺少該序列，所以出現游離的單鏈區。

（2）用PCR技術擴增X基因時，設計兩種引物的堿基序列的主要依據是X基因兩端的部分脫氧核苷酸序列，為了便于擴增后的X基因與質粒連接，常在兩條引物上設計加入不同的限制酶酶切位點，主要目的是使X基因能定向插入表達載體，減少酶切產物自身環化。

（3）將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是農桿菌轉化法，農桿菌能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，將質粒上的T-DNA轉移到受體細胞。將目的基因導入動物細胞常用顯微注射法，這也是將目的基因導入動物細胞最有效的方法。

（4）若要檢測抗稻瘟病基因是否翻譯出相應蛋白質，分子水平上可采用抗原-抗體雜交法進行檢測。