Question

【題目】利用酵母菌分解廢紙是一種環保的方式，但廢紙中的纖維素分子量大不能直接進入酵母菌，且酵母菌無法分解利用環境中的纖維素。為解決這一難題，科學家將纖維素酶基因通過重組質粒導入酵母菌。其所用質粒及其酶切位點如下圖1，外源DNA上的纖維素酶基因及其酶切位點如圖2。請回答下列問題：

（1）圖1、圖2中的質粒和纖維素酶基因分別作為重組DNA技術中的_______，為使兩者能夠有效組合，圖中可選用的最合適的限制酶是_______。

（2）若質粒被HindⅢ限制酶識別的序列是-AAGCTT -，并在A與A之間切割。請畫出被切割后所形成的黏性末端_____________。

（3）科學家進一步構建了含3種不同基因片段的重組質粒，進行了一系列的研究。下圖3是酵母菌轉化及纖維素酶在工程菌內合成與運輸的示意圖。

①圖3中已導入重組質粒的菌株有______ 。

②設置菌株Ⅰ作為對照，是為了驗證_______均不攜帶纖維素酶基因。

③將4株菌株分別置于以纖維素為_______的培養基上，其中_______兩個菌株不能存活。

④據圖推測A基因片段的作用是_______。

Answer 1

【答案】運載體和目的基因 Hind III和PstI 菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 質粒和酵母菌 唯一碳源 菌株Ⅰ和菌株Ⅱ 使纖維素酶可以固定于細胞壁表面

【解析】

1、選擇限制酶的方法

(1)根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類

①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。

②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。

③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。

(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類

①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。

②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制起點區，則切割重組后的片段進入受體細胞后將不能自主復制。

2、分析圖2可知，纖維素酶基因的兩端存在HindⅢ和PstⅠ的酶切位點。使用同一種限制酶切割目的基因和質粒，容易導致目的基因或質粒自身連接；纖維素酶為胞外酶，該酶在核糖體上合成，依次經過內質網和高爾基體加工，最后通過胞吐釋放到細胞外。

（1）根據題意可知，將纖維素酶基因通過重組質粒導入酵母菌，則圖2中的纖維素酶基因為目的基因，質粒是運載目的基因的運載體。據圖2可知，纖維素酶基因中存在BamHⅠ的酶切位點，因此不能選擇BamHⅠ切割目的基因；只使用PstⅠ切割目的基因和質粒，可能出現目的基因或質粒的自身連接，因此為使纖維素酶基因能夠與質粒有效組合，應選用最合適的限制酶是HindⅢ和PstⅠ。

（2）質粒被Hindlil限制酶識別的序列是一AAGCTT一，并在A與A之間切割磷酸二酯鍵，則被切割后所形成的黏性末端為和。

（3）①據圖3可知，菌株Ⅰ中導入的是普通質粒，菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中導入的是重組質粒。

②設置菌株I作為對照，根據其不能合成纖維素酶可判斷質粒DNA和酵母菌基因組不攜帶纖維素酶基因。

③篩選可分泌纖維素酶的轉基因酵母菌，可將4株菌株分別置于以纖維素為唯一碳源的培養基上。據圖可知，菌株Ⅱ中缺少信號肽編碼序列，導致所產生的纖維素酶無法分泌到細胞外，分解細胞外的纖維素，使得細胞無可利用的碳源，由于菌株Ⅰ中導入的是普通質粒，其不能合成纖維素酶，不能利用培養基中的碳源，因此菌株Ⅰ和菌株Ⅱ因不能利用纖維素碳源不能存活。

④識圖分析可知，圖3中菌株Ⅳ導入的重組質粒中含有纖維素酶基因、A基因片段和信號肽編碼序列，其與菌株Ⅱ、Ⅲ相比可以看出，分泌的纖維素酶固定于細胞壁表面，因此推測A基因片段的作用使纖維素酶可以固定于細胞壁表面。