Question

【題目】融合PCR技術是采用具有互補末端的引物，將不同來源的擴增片段連接起來的方法，其過程如下圖1所示。下圖2是中間載體1和中間載體2（利用融合PCR技術構建成）構建成葉綠體定點整合表達載體示意圖（限制酶酶切位點標注于載體外側），葉綠體定點整合表達載體通過與葉綠體基因的同源重組，將目的基因整合于葉綠體DNA上的特定位點上。請據圖回答下列問題。

（1）圖1第一階段中PCR至少進行____________次循環，才能獲得雙鏈等長的DNA，第二階段中引物2與引物3部分堿基的____________關系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來。

（2）若通過融合PCR技術將啟動子、標記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設計__________種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有__________種。

（3）圖2中需使用_________________（填限制酶）和DNA連接酶將兩中間載體構建成定點整合表達載體，途中定點整合表達載體上未標出的結構是__________。

（4）葉綠體定點整合表達載體中____________（填基因）能使目的基因準確插入葉綠體DNA上的特定位點上。與利用農桿菌轉化法相比，利用定點整合表達載體將目的基因導入葉綠體中的優點是_______。

Answer 1

【答案】 2 互補配對 8 6 Spe I、Sal I 復制原點 葉綠體同源重組基因1和葉綠體同源重組基因2 能實現定點整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴散帶來安全問題

【解析】試題分析：熟記并理解基因工程的基本操作程序，特別是利用PCR技術擴增目的基因的過程等相關的基礎知識，形成清晰的知識網絡。在此基礎上結合題意并從題圖中提取信息進行相關問題的作答。

(1)分析圖1可知：在第一階段中，利用PCR技術進行第一次擴增（循環），得到的含有引物2、引物3的產物，其DNA雙鏈不等長，該產物繼續進行第二次擴增（循環），才能獲得雙鏈等長的DNA。第二階段中引物2與引物3部分堿基的互補配對關系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來。

(2)圖1顯示：通過融合PCR技術，每一次將兩個DNA片段拼接起來，需要4個引物，其中有2個起著“搭橋”作用。依此類推，若通過融合PCR技術將啟動子、標記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設計8種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有6種。

(3) 圖2顯示：啟動子和終止子的兩端分別有Spe I和Sal I的識別位點，葉綠體同源重組基因1與2之間也存在Spe I和Sal I的識別位點，因此圖2中需使用Spe I、Sal I和DNA連接酶將兩中間載體構建成定點整合表達載體，圖中定點整合表達載體上未標出的結構是復制原點。

(4)綜上分析：在葉綠體定點整合表達載體中，葉綠體同源重組基因1和葉綠體同源重組基因2能使目的基因準確插入葉綠體DNA上的特定位點上。與利用農桿菌轉化法相比，利用定點整合表達載體將目的基因導入葉綠體中的優點是：能實現定點整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴散帶來安全問題。