Question

【題目】Bar基因存在于青麻、黑麥草等生物體內，其編碼的酶可使除草劑草丁膦失去毒害作用。培育轉Bar基因大豆，對于控制豆田雜草有重要意義。為了把Bar基因導人大豆細胞，需將Bar基因插入pUcl8質粒中構建中間表達載體，然后與Ti質粒重組為重組表達載體系統。如圖為pUcl8質粒的結構示意圖，回答下列問題：

（1）不能利用黑麥草與大豆進行有性雜交的方法讓大豆獲得Bar基因，原因是_______________。

（2）構建中間表達載體時，為了便于篩選出含有Bar基因的重組質粒，需將Br基因插入到pUcl8質粒的______中形成重組質粒并導入大腸桿菌，然后在添加______的培養基上培養大腸桿菌，菌落呈白色的即為含中間表達載體的大腸桿菌。

（3）中間表達載體需插入到Ti質粒的T-DNA中，原因是_______________。

（4）可通過______法直接將重組表達載體導入大豆細胞的原生質體。導入Bar基因的原生質體需__________________成為完整的植物細胞，經脫分化形成______，再進一步分化才能獲得轉Bar基因大豆植株。

Answer 1

【答案】黑麥草與大豆之間存在生殖隔離 lacZ 氨芐青霉素和Xgal T-DNA可轉移至受體細胞并整合到受體細胞的染色體DNA上 顯微注射 再生出細胞壁 愈傷組織

【解析】

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）由于黑麥草與大豆之間存在生殖隔離，因此不能利用黑麥草與大豆進行有性雜交的方法讓大豆獲得Bar基因。

（2）根據圖中信息可知，lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶可以將培養基中的Xgal水解，使菌落呈藍色，否則菌落呈白色。因此，構建中間表達載體時，為了便于篩選出含有Bar基因的重組質粒，需將Br基因插入到pUcl8質粒的lacZ中形成重組質粒并導入大腸桿菌，然后在添加氨芐青霉素和Xgal的培養基上培養大腸桿菌，菌落呈白色的即為含中間表達載體的大腸桿菌。

（3）Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。根據這一特點，如果將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上。

（4）可通過顯微注射法直接將重組表達載體導入大豆細胞的原生質體。導入Bar基因的原生質體需再生出細胞壁，經脫分化形成愈傷組織，再進一步分化才能獲得轉Bar基因大豆植株。