Question

【題目】華蟾素注射液是將蟾蜍的全皮陰干后，提煉而成的中藥復(fù)方制劑，是我國經(jīng)典抗腫瘤藥物。研究人員為探尋華蟾素注射液抗肝癌HepG-2細(xì)胞的作用機理，進行了一系列實驗。請根據(jù)題中信息回答下列問題。

Ⅰ.肝癌HepG-2細(xì)胞的培養(yǎng)：

（1）培養(yǎng)肝癌HepG-2細(xì)胞時，在培養(yǎng)基中加入適量的__________以補充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)，為防止培養(yǎng)過程發(fā)生污染要加入______。此外，每48h更換1次培養(yǎng)液，目的是__________。同時還要提供適宜的溫度、______、氧氣和二氧化碳等環(huán)境條件。

Ⅱ.探究華蟾素藥效作用機理的實驗：

（2）用不同濃度的華蟾素注射液分別處理HepG-2細(xì)胞12h、24h和48h，測定華蟾素注射液對HepG-2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如下圖。

由圖甲可知，華蟾素能有效地______肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，且與______呈正相關(guān)。圖乙的結(jié)果進一步表明，華蟾素對肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響體現(xiàn)在______________。

（3）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（簡稱TopoⅡ）為真核生物所必需，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及形成正確的染色體結(jié)構(gòu)、染色體分離、濃縮等方面發(fā)揮重要作用，TopoⅡ在腫瘤細(xì)胞中含量明顯高于正常細(xì)胞。華蟾素注射液處理HepG-2細(xì)胞48h后，采用RT-PCR技術(shù)檢測TopoⅡ基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖丙。

①RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。其主要原理是：提取HepG-2細(xì)胞中的總RNA， 以一段_______作為引物，在________酶的作用下合成cDNA，再以cDNA為模板進行_________。

②由圖丙可知，華蟾素注射液在基因水平上影響肝癌HepG-2細(xì)胞的機理是______。

Answer 1

【答案】 血清（血漿） 抗生素 防止代謝物積累對細(xì)胞自身造成危害（補充細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì)） pH 抑制 作用時間和濃度 將癌細(xì)胞阻滯在S期 與TopoⅡmRNA互補的單鏈DNA 逆轉(zhuǎn)錄 PCR擴增 抑制TopoⅡ基因的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)，最終導(dǎo)致TopoⅡ含量降低

【解析】【試題分析】

1．在動物細(xì)胞培養(yǎng)時，所需營養(yǎng)物質(zhì)有糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。將這些營養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基，稱為合成培養(yǎng)基。由于人們對細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，因此，在使用合成培養(yǎng)基時，通常需加入血清、血漿等一些天然成分。

2．逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。

（1）在動物細(xì)胞培養(yǎng)時，通常在合成培養(yǎng)基中加入適量動物血清，以補充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)；為防止培養(yǎng)過程發(fā)生污染要加入一定量的抗生素；定期更換培養(yǎng)液的目的是清除代謝產(chǎn)物，防止代謝物積累對細(xì)胞自身造成危害（補充細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì)）；同時還要提供適宜的溫度、pH、氧氣和二氧化碳等環(huán)境條件。

（2）分析圖甲可知，隨著華蟾素注射液濃度的增加和作用時間的延長，對HepG-2細(xì)胞的抑制率增大，說明華蟾素能有效地抑制肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，且與作用時間和濃度呈正相關(guān)；由圖乙可知，隨著華蟾素注射液濃度的增加，肝癌HepG-2細(xì)胞S期細(xì)胞細(xì)胞比例增大，表明華蟾素對肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響體現(xiàn)在將癌細(xì)胞阻滯在S期。

（3）①RT-PCR主要原理是：提取HepG-2細(xì)胞中的總RNA， 以一段與TopoⅡmRNA互補的單鏈DNA作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。

由圖丙可知，華蟾素注射液在基因水平上影響肝癌HepG-2細(xì)胞的機理是抑制TopoⅡ基因的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)，最終導(dǎo)致TopoⅡ含量降低。