Question

【題目】蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對人體沒有影響。我國科學家欲獲得高效表達蛋白A的轉基因大腸桿菌作為微生物農藥，做了相關研究。

（1）研究者用相同的________酶處理蛋白A基因和pET質粒，得到重組質粒，再將重組質粒置于經________處理的大腸桿菌細胞懸液中，獲得轉基因大腸桿菌。

（2）檢測發現，轉入的蛋白A基因在大腸桿菌細胞中表達效率很低，研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設計了與蛋白A基因結合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個堿基），并按圖2方式依次進行4次PCR擴增，以得到新的蛋白A基因。

①這是利用PCR技術實現了定點的________。

②圖2所示的4次PCR應該分別如何選擇圖1中所示的引物？請填寫以下表格（若選用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”）。

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1
PCR2
PCR3
PCR4

________

（3）研究者進一步將含有新蛋白A基因的重組質粒和________分別導入大腸桿菌，提取培養液中的蛋白質，用________方法檢測并比較三組受體菌蛋白A的表達產物，判斷新蛋白A基因表達效率是否提高。為檢測表達產物的生物活性，研究者將上述各組表達產物加入到長滿了植物病菌的培養基上，培養一段時間后，比較________的大小，以確定表達產物的生物活性大小。

（4）作為微生物農藥，使用時常噴灑蛋白A基因的發酵產物而不是轉蛋白A基因的大腸桿菌，其優點是________________。

Answer 1

【答案】限制酶和DNA連接 CaCl2 基因突變

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	√	√	×	×
PCR2	×	×	√	√
PCR3	×	×	×	×
PCR4	√	×	×	√

含有蛋白A基因的重組質粒、空質粒（pET質粒） 抗原-抗體雜交 抑菌圈 對人、畜、農作物和自然環境安全；不會造成基因污染；有效成分純度較高

【解析】

本題主要考查基因工程、PCR技術等相關知識。PCR技術擴增目的基因原理：DNA雙鏈復制；過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。

（1）在基因工程中，利用相同的限制酶和DNA連接酶處理蛋白A基因和pET質粒，得到重組質粒；大腸桿菌作為受體細胞，需要用氯化鈣處理，以便重組質粒的導入。
（2）①根據題意和圖示分析，經過4次PCR技術后獲得了新的基因，這是一種定點的基因突變技術。
②研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設計了與蛋白A基因結合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個堿基），DNA子鏈從5'端向3'端延伸，因此4次PCR應該分別選擇如圖所示的引物：如下表所示。

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	√	√	×	×
PCR2	×	×	√	√
PCR3	×	×	×	×
PCR4	√	×	×	√

（3）將含有新蛋白A基因的重組質粒和含有蛋白A基因的重組質粒、空質粒（pET質粒）分別導入大腸桿菌，提取培養液中的蛋白質，用抗原-抗體雜交方法檢測并比較三組受體菌蛋白A的表達產物，判斷新蛋白A基因表達效率是否提高。為檢測表達產物的生物活性，研究者將上述各組表達產物加入到長滿了植物病菌的培養基上，培養一段時間后，比較抑菌圈的大小，可以確定表達產物的生物活性大小。
（4）作為微生物農藥，使用時常噴灑蛋白A基因的發酵產物而不是轉蛋白A基因的大腸桿菌，是因為蛋白A基因的發酵產物對人、畜、農作物和自然環境安全；不會造成基因污染；有效成分純度較高。